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伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）是能引起小反刍动物,尤其是绵羊和山羊患病,也可引起牛、马、骆驼、猪等多种动物患病的一种革兰氏阳性菌,是慢性传染病干酪样淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）的重要病原。世界上大多数羊群的地区均存在CLA流行。伪结核棒状杆菌一旦进入羊群,极其容易造成养羊业的经济损失,因为要控制和清除该病原非常困难。除此之外,该病原还可侵袭人,导致各种疾病的出现,如:造成淋巴结炎、肺炎及心内膜炎等,潜在地危害着人类身体健康。因此,迫切需要研究能有效降低该病原感染的防控方案。目前我国主要通过药物和手术治疗伪结核棒状杆菌病。因该病引起的包囊膜较厚,包囊内脓汁干稠,发病后药物治疗效果不理想。手术治疗需对每头患病羊检查实施手术,治疗效率低,而且排脓时极易污染环境。因此,控制该病最有效的手段是疫苗免疫。虽然我国众多地区报道伪结核棒状杆菌感染和流行,但是目前国内尚无商品化疫苗生产和使用。由于活疫苗具有免疫力产生快,免疫持续时间长,免疫效果好,成本较低的特点。在课题组前期从感染山羊的伪结核棒状杆菌临床分离株中筛选获得4株致病力较弱菌株基础上,本文对所选菌株进行致病力重复试验和免疫保护试验,以筛选出致病力低并且免疫原性好的弱毒疫苗候选株。进一步采取物理诱变、化学诱变和复合诱变等方式对所选择菌株进行传代致弱,期望能培育获得致病力低而免疫效果良好的候选疫苗株,为伪结核棒状杆菌弱毒疫苗的研制奠定科学基础。具体结果如下:1.伪结核棒状杆菌弱毒苗候选菌株的筛选对本实验室前期初步筛选获得的4株致病力相对较弱的伪结核棒状杆菌临床分离株,即大足株（DZ6）、涪陵株（FL2-5）、云阳株2（YY2）和云阳株6（YY6）,进一步开展对小鼠的致病力重复试验和免疫原性检测,以筛选出毒力较弱而免疫原性较好的菌株为伪结核棒状杆菌弱毒疫苗候选株。结果显示,以4株菌的菌液OD450=0.08接种昆明系小鼠的平均存活时间/存活率分别为:187.4 h/20%（YY2）、228.4 h/40%（FL2-5）和318.8 h/80%（DZ6）,而YY6因培养污染没有数据;4株菌免疫后对4×LD50万州强毒株（WZ）攻毒保护率分别为:50.00%（YY2）、66.67%（DZ6）、33.33%（FL2-5）和16.67%（YY2）。提示DZ-6株伪结核棒状杆菌的致病力较低,且具有较好的免疫原性,确定为后续研究该病原的弱毒苗候选菌株。2.伪结核棒状杆菌弱毒苗候选菌株的致弱及生物学特性研究采取物理诱变（紫外线、较高温度作用）、化学诱变（亚硝酸盐作用）和复合诱变（紫外线+硝酸盐作用）方式,对DZ6伪结核棒状杆菌弱毒苗候选株进行连续诱变传代培养致弱。观察不同方法致弱对DZ6菌落形态、生长特性、致病力和免疫原性方面的影响。结果确定紫外线作用时间为1 min,对伪结核棒状杆菌致死率为86.5%,亚硝酸盐作用时间为3 min,对伪结核棒状杆菌致死率为83.1%,以41℃下培养24 h,对伪结核棒状杆菌致死率为83.3%。以上述诱变条件对DZ6诱变传代培养20代后,发现不同条件诱变传代培养20代菌株从8 h开始,生长明显快于原代菌株外,其菌落形态和染色特点与原代菌株相比无明显改变。原代菌株和常规划线传代、紫外线诱变、紫外线大诱变、亚硝酸诱变、紫外线+亚硝酸复合诱变、41℃诱变条件培养下20代菌株以1×106 CFU/0.2mL/只皮下注射小鼠后,致死率分别为:60.0%、60.0%、53.5%、33.3%、60.0%、40.0%和20.0%。与DZ6原代菌株相比,41℃诱变20代菌株的脾脏载菌量和脓肿个数均显著下降、肝脏载菌量明显下降,其他诱变传代培养菌株无显著性差异,各诱变传代菌株脾脏指数无显著性差异;以DZ6及其41℃诱变20代菌株免疫后对10×LD50万州强毒株（WZ）攻毒保护率分别为:40.00%（原代菌株DZ6）和60%（41℃诱变传代培养菌株DZ6WD-20）。表明通过41℃诱变传代培养可降低DZ6的致病力,而对其免疫原性无明显影响。3.伪结核棒状杆菌弱毒苗候选菌株致弱机制的初步探究为探究高温诱变降低菌株毒力的机制,与伪结核棒状杆菌原代菌株DZ6对比,采用实时荧光定量PCR方法检测41℃下培养诱变20代菌株（DZ6WD-20）编码磷脂酶（PLD）、σE因子（sigE）、小菌毛蛋白（SpaC）、神经氨酸酶（NanH）、苏氨酸蛋白激酶G（PknG）和超氧化物歧化酶（SodC）毒力因子表达量情况,分析较高温度培养诱变对伪结核棒状杆菌毒力基因表达的影响。同时对菌株主要毒力基因PLD进行了测序,分析41℃培养诱变20代是否会引起该毒力基因序列发生突变。结果显示,与原代菌株大足株（DZ6）相比,41℃下培养诱变20代菌株（DZ6WD-20）毒力基因NanH和SodC表达显著降低（p<0.05）,毒力基因PLD、sigE、SpaC和PknG表达极显著降低（p<0.01）,测序结果显示传代后的伪结核棒状杆菌PLD基因序列无任何改变。提示41℃培养诱变DZ6致病力下降可能与下调伪结核棒状杆菌的PLD、sigE、SpaC、NanH、PknG、SodC毒力因子表达有关。综上所述,本研究筛选获得一株伪结核棒状杆菌弱毒苗候选菌株（DZ6）;发现通过41℃培养传代可降低该疫苗候选株的致病力,而不影响其免疫原性;其致弱机制可能与41℃温度诱导培养中下调PLD、sigE、SpaC、NanH、PknG、SodC毒力因子的表达有关。本研究结果为后期对该疫苗株的进一步传代致弱和山羊伪结核棒状杆菌弱毒疫苗研制奠定基础。