AddaVax联合Poly I:C增强流感疫苗免疫效应的机制研究

来源 :武汉生物制品研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zs1979
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【背景目的】尽管流感疫苗具有一定的免疫原性,但是在流感大流行期间以及在免疫反应低下的人群中,现有的流感疫苗的保护效力有限,因此,需要佐剂以增强机体对流感疫苗的应答,进而增强疫苗的免疫保护能力。传统佐剂主要诱导体液免疫应答,而忽略了细胞免疫应答在疫苗保护中的作用,促进Th1和Th2免疫应答的新型佐剂也成为一种新的研究方向。本研究探索了促进体液免疫的水包油佐剂Adda Vax和促进细胞免疫的TLR激动剂Poly I:C制备成的复合佐剂AP促进流感疫苗免疫应答的机制及其在流感疫苗中的应用。【方法】1.AP佐剂对流感疫苗体液免疫的增强作用。AP佐剂的佐剂活性优势:单价H3N2疫苗(5μg)配伍AP佐剂和传统的铝佐剂,初次免疫后21天,检测小鼠的血清抗体滴度;剂量效应关系:3、6、9、15μg单价H3N2疫苗配伍AP佐剂,分别免疫BALB/c小鼠和Wistar大鼠,进行0、21天的免疫程序,免疫程序完成后的第21检测血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)抗体滴度;B细胞效应:单价H3N2疫苗(5μg)配伍AP佐剂免疫BALB/c小鼠,初次免疫后第4、7、14、21、28天和加强免疫后第4、28天,Elispot检测H3N2血凝素(Hemagglutinin,HA)特异性抗体分泌细胞,同时检测血清HI抗体滴度;抗体的长期效性:单价H3N2疫苗(5μg)配伍AP佐剂,免疫BALB/c小鼠,进行0、21天的免疫程序,免疫程序完成后第21天、100天、270天,检测小鼠体内HI抗体滴度;四价裂解疫苗的免疫原性:四价流感裂解疫苗配伍AP佐剂,进行0、21天的免疫程序,并检测四型流感的抗体滴度。2.免疫原性和免疫微环境之间的关系。单价H3N2疫苗与AP佐剂混匀后免疫小鼠、或将单价H3N2疫苗和AP佐剂间隔1、24、48小时免疫小鼠,21天检测血清HI抗体滴度;单价H3N2疫苗配伍AP佐剂免疫小鼠0、24、48、120小时后,检测注射部位的细胞因子分泌;小鼠肌肉单独注射AP佐剂4、24小时后,使用q RT-PCR检测免疫部位的趋化因子和细胞因子的表达;H3N2+AP免疫小鼠2天后,流式检测注射部位的巨噬细胞水平。3.DCs介导的免疫应答。体外诱导培养小鼠骨髓来源的未成熟的树突状细胞(Bone marrow dendritic cells,BMDCs),用AP、Adda Vax、Poly I:C刺激未成熟的BMDCs,流式细胞术检测BMDCs表面成熟分子的表达和细胞因子的分泌。Cy5.5标记H3N2蛋白(Cy5.5-H3)分别联合AP、Adda Vax、Poly I:C,刺激BMDCs,检测BMDCs摄取Cy5.5-H3情况。BMDCs和免疫后的小鼠脾脏T细胞共培养,H3N2蛋白分别和AP、Adda Vax、Poly I:C刺激共培养的细胞,检测共培养细胞分泌IL-4和IFN-γ的能力。4.引流淋巴结中的免疫应答。Cy5.5-H3联合AP,免疫BALB/c小鼠2天后,免疫组化定位Cy5.5-H3、B细胞、T细胞、巨噬细胞和DCs在引流淋巴结中的位置。检测单价H3N2疫苗配伍AP佐剂免疫小鼠0、24、60小时后引流淋巴结中免疫细胞动态变化,初次免疫后4、7、14、21、28天和加强免疫后4、14、28天引流淋巴结生发中心的形成。5.脾细胞免疫应答。单价H3N2疫苗配伍AP佐剂加强免疫后第5天,眼静脉采血ELISA检测单价H3N2疫苗HA特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体,分离小鼠脾脏,脾细胞用H3N2抗原刺激培养两天,流式方法检测脾细胞分泌的免疫相关细胞因子。同时,使用ELIspot检测分泌IL-4和IFN-γ的T细胞水平。6.佐剂对疫苗蛋白代谢的影响。Cy5.5-H3配伍AP肌肉免疫BALB/c小鼠,免疫后0、2、5、7、9、11、13、15天,检测Cy5.5-H3在小鼠体内的代谢。7.佐剂疫苗的耐受性评价。高剂量的AP佐剂、H3+AP免疫BALB/c小鼠和Wistar大鼠,采用0、14、28天的免疫程序,每次免疫后连续7天和第14天监测小鼠的体重和生命体征变化。在三次免疫后的第7天,眼静脉取血,ELISA方法检测血清中C反应蛋白水平。在初次免疫后3天,检测引流淋巴结的大小和质地,计算淋巴结评分,加强免疫后5天分离脾脏并称重,计算脾指数。8.攻毒保护试验。单价流感疫苗分别免疫BALB/c小鼠,采用0、21天免疫程序,免疫程序完成后的低28天,使用致死剂量的毒株对小鼠进行滴鼻攻毒,监测小鼠的生命体征、体重、体温、生存曲线、肺组织病毒载量和病理变化评估疫苗配伍AP后的体内保护效力。【结果】1.AP佐剂增加了单价H3N2疫苗和IIV4的免疫原性。AP佐剂的佐剂活性优势:与传统的铝佐剂相比,H3+AP诱导了高水平的抗体滴度;剂量效应关系:3、6、9、15μg剂量组的单价H3N2疫苗配伍复合佐剂AP,在BALB/c小鼠和Wistar大鼠体内诱导的抗体滴度都存在剂量效应关系;B细胞效应:单价H3N2疫苗配伍AP促进了H3N2特异性抗体分泌细胞的增殖、分化,促进了H3N2疫苗中HA特异性抗体的分泌。在加强免疫后4天,抗体分泌细胞和抗体滴度就出现显著性增强;抗体的长期效性:单价H3N2疫苗(5μg)配伍AP、Adda Vax、Poly I:C后,免疫程序完成后的第21天,抗体效价最高,随着时间延长,抗体滴度逐渐下降,但是H3+AP组的抗体滴度在免疫程序结束后的21、100、200、270天依旧高于其他组。在第270天,H3+AP组的抗体滴度大于40,高于抗体保护界值;四价裂解疫苗的免疫原性:用IIV4+AP免疫的小鼠,其产生的四型流感病毒株的HI和MN滴度均高于IIV4免疫的小鼠抗体水平。2.免疫原性和免疫微环境关系。单价H3N2疫苗和AP先混匀再肌肉免疫小鼠,或者同时间免疫(不预混匀),诱导的HI抗体滴度没有统计学差异,单价H3N2疫苗和AP间隔免疫小鼠的时间越长,诱导的抗体滴度越低;H3+AP在注射部位诱导的一过性细胞因子(IL-5、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、TGF-β)水平相对高于单价H3N2疫苗诱导的;AP单独免疫小鼠后4、24小时,与PBS组相比,IL-6、CCL2、CCL3、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、IFN-α、IFN-γm RNA表达水平增高;H3+AP免疫后2天,免疫部位的巨噬细胞(M1、M2)数量增高。3.DCs介导的免疫应答。AP促进了未成熟BMDCs表面成熟标志CD40、CD80、CD86的表达和细胞因子IL-12的分泌;AP促进了BMDCs对Cy5.5标记的抗原的摄取;H3N2、H3+Adda Vax、H3+Poly I:C、H3+AP促进了BMDCs和脾脏T淋巴共培养细胞IL-4和IFN-γ的分泌。4.引流淋巴结的免疫应答。Cy5.5-H3联合AP肌肉免疫小鼠后2天,在Cy5.5-H3+AP组小鼠引流淋巴结中检测到Cy5.5荧光,而在Cy5.5-H3组小鼠引流淋巴结中未检测到Cy5.5荧光;在免疫后4、24、60小时,H3+AP、H3N2均促进了引流淋巴结中B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、DCs的增殖;在初次免疫后第7、14、21天和加强免疫4、14天,H3+AP促进了淋巴结中的生发中心的形成。5.脾细胞中诱导的免疫应答。H3+AP组小鼠中脾淋巴细胞分泌的抗原特异性IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ水平高于H3N2组;H3+Add组和H3+AP组分泌IL-4的免疫细胞量相当,均高于H3N2疫苗组,H3+Poly I:C组和H3+AP组的分泌IFN-γ免疫细胞相当,均高于H3N2疫苗组;单价H3N2疫苗(5μg)配伍AP、Adda Vax、Poly I:C后,ELISA检测H3+AP组的Ig G抗体滴度和Ig G2a/Ig G1比值高于H3N2疫苗组(P<0.05)。6.抗原在小鼠体内代谢。Cy5.5-H3联合Adda Vax、Poly I:C、AP免疫小鼠后,Cy5.5荧光在第15天消失,而Cy5.5-H3组小鼠,在第15天仍然可以检测到Cy5.5荧光。7.佐剂疫苗的耐受性评价。45μg H3N2、500μL AP、15μg H3+AP、45μg H3+AP、500μL PBS间隔两周免疫BALB/c小鼠和Wistar大鼠,BALB/c小鼠体重变化:在初次免疫和二次后3天,小鼠体重各组间具有统计学差异,三次免疫后各组间体重没有统计学差异。Wistar大鼠的体重变化:各组间没有统计学差异。C反应蛋白:三免后的第7天,BALB/c小鼠中,15μg H3+AP组与45μg H3N2组的CRP蛋白水平高于其他组,Wistar大鼠中,各组间CRP蛋白水平无显著性差异。H3N2组与H3N2配伍佐剂组的脾指数和淋巴结评分,没有统计学差异。8.攻毒保护试验。单价流感疫苗配伍佐剂免疫BALB/c小鼠,使用对应的高致病的流感病毒株进行攻毒挑战试验,显示H1+AP组、BV+AP组、BY+AP组小鼠体重降低在5%以内,第6天体重回升、生命体征较好,第6天病理观察肺组织炎症反应较弱、肺组织病毒载量低于检测下限。【结论】1.制备了Adda Vax和Poly I:C新型复合佐剂(AP)。AP佐剂诱导了局部微环境中细胞因子和趋化因子的表达、局部免疫细胞的增殖分化,促进了抗原提呈细胞的成熟和对抗原的摄取,进而增强了引流淋巴结和脾脏等外周免疫器官的免疫应答,诱导了较平衡的细胞免疫和体液免疫,在增强流感疫苗的免疫保护效果上具有重要作用。2.AP佐剂流感疫苗具有较好的耐受性。3.通过小鼠感染模型,AP复合佐剂流感疫苗主动保护效果良好,可成为安全且有效的新型佐剂流感候选疫苗,为流感疫苗的研究奠定了基础。
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