论文部分内容阅读
重组乙肝疫苗是目前唯一一种广泛使用的基因工程疫苗,它具有原料易得、产量大、安全、高效等特点,在预防乙型肝炎病毒感染方面发挥了重要作用。但从大面积接种的情况来看,有10%左右的健康人群接种后对其无应答或低应答。一般,疫苗不能产生有效的保护作用,需要从机体和疫苗两个角度研究和改进,从而提高疫苗的有效性。本论文从改善疫苗免疫原性的理论出发,利用基因工程的方法,在毕赤酵母中融合表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)与粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),并对此融合蛋白的免疫原性进行检测,旨在探索一种提高HBsAg免疫原性的新方法。 应用PCR方法得到HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接获得HBsAg和GM-CSF的融合基因GM-s和s-GM后,克隆到酵母穿梭质粒pPIC9K,经酶切鉴定和测序表明构建的含融合基因的重组质粒与理论设计一致。将两个重组质粒电转化毕赤酵母GS115后,G418筛选,甲醇诱导,分泌表达GM-CSF-HBsAg(GS)和HBsAg-GM-CSF(SG)融合蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,顺序不同的两种融合蛋白GS、SG在毕赤酵母中均获得了表达,表达量最高可占到上清中总蛋白的55%,表观分子量为32KD;Westen blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合,为HBsAg和GM-CSF的融合蛋白。收集上清,超滤浓缩后经离子交换柱一步纯化即可得到纯度达90%以上的融合蛋白。 将纯化的融合蛋白免疫小鼠,小鼠随机分为5组:①对照组注射生理盐水;②S组注射本室保存的毕赤酵母表达的HBsAg;③S+GM组在S组的基础上添加GM-CSF;④GS组注射融合蛋白GS:⑤SG组注射融合蛋白SG。0、2、4周各免疫一次,第一次免疫后每隔两周,尾动脉采血收集血清,ELISA检测免疫小鼠血清中抗HBsAg抗体水平。发现,第一次免疫后4周出现抗HBsAg抗体,6周时各组阳转率分别为S组50%;S+GM组100%;GS组66%;SG组100%,