药用菊花为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，具有疏风清热、平肝明目、清热解毒之功效。杭菊(C.morifolium cv.Hangju)是药用菊花的主要栽培品系之一，主要化学成分包括黄酮类、挥发油类、绿原酸类等。其中黄酮醇及其衍生物作为重要的一种黄酮类化合物显示出非常有价值的生物学和药理学活性，也是杭菊药用品质形成的重要物质基础之一。前期杭菊品质研究发现，原产地(浙江桐乡)的杭菊在药材商品性状和活性指标成分上较引种区域有优势，尤其是黄酮类成分含量上。综合分析各产地环境因子，引种区域与原产地的环境差异主要表现在年降水量的差异，原产地桐乡地处夏季台风区，尤其8月降水量极显著高于其他区域，同时8月中下旬正值早小洋菊花芽分化的特殊生理期。基于此情况，本研究模拟杭菊花芽分化期受到的淹水胁迫，并选取黄酮醇合成途径中的关键基因，来探究淹水胁迫对杭菊黄酮醇合成途径中关键酶基因表达量及其品质形成的影响，取得主要研究结果如下:
　　(1)基于杭菊转录组数据库，分别利用RT-PCR克隆技术和RACE技术克隆出了杭菊黄烷酮3-羟化酶基因(暂命名CmF3H)和黄酮醇合酶基因(暂命名CmFLS)，并对其进行了生物信息学分析。结果显示CmF3H开放阅读框长1095bp，编码364个氨基酸，蛋白的分子量约为41.15kDa，理论等电点(PI)为5.80，预测该蛋白的二级结构显示α螺旋占31.04％，β折叠占16.21％，随机卷曲占52.75％;CmFLS基因全长1235bp，包含一个l008bp的开放阅读框(ORF)，编码335个氨基酸，预测得到的CmFLS编码的蛋白分子量为37.96kDa，等电点(pI)为5.41，二级结构预测发现α-螺旋结构占氨基酸序列的23.88％，延伸链占15.22％，无规则卷曲占60.90％。为了更好地了解这2个基因的结构和功能，使用同源建模的方法构建了蛋白的3D模型，同时采用Test Neighbor-Joining法构建系统进化树，进化树分析发现这2个基因在科属内变异程度不大，相对保守。
　　(2)本实验在杭菊花茅分化期进行淹水胁迫，以β-actin为内参基因，使用Real-timePCR检测CmF3H和CmFLS的相对表达量:然后分别使用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法和HPLC测量杭菊头状花序中的总黄酮含量和指标成分含量。Real-time PCR结果表明CmF3H和CmFLS对淹水胁迫有明显响应，其中处理组的CmF3H对淹水胁迫的响应一直处于上调水平，且在不同时期上调程度有波动，在处理后75d时的上调水平最大达到80.9％;CmFLS表达情况呈现先下调再上调的趋势，其中处理组在淹水后30d内CmFLS的表达量显著低于对照组，但从45d后开始显著上调，一直持续到盛花期，在第30d时基因表达量下调程度最大，相对表达量比对照组低36.9％;75d时上调程度最大，比对照组高67.7％。含量测定结果显示处理组总黄酮含量为2.81％，比对照组高出17.57％;同时发现淹水处理能够显著提高绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，其中绿原酸含量从0.32％增加到0.41％，木犀草苷含量从0.19％增加到0.22％，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸从0.82％增加到0.96％。因此在花芽分化期进行淹水胁迫可以显著改变CmF3H和CmFLS的相对表达量，增强杭菊活性成分的积累。
　　(3)为验证克隆出CmF3H和CmFLS基因的正确性及进一步研究该基因的功能。本实验利用原核表达技术成功诱导出了相应的重组融合蛋白。其中CmF3H重组融合蛋白大小在80kDa左右，酶切去除MBP标签后目的蛋白在41kDa左右。与预测值一致;然后使用Amylose磁珠法纯化出目的蛋白并利用酶联免疫分析其蛋白活性，结果表明带MBP标签的重组融合蛋白和去除标签的目的蛋白均具有黄烷酮3-羟化酶活性，且去除标签后的目的蛋白活性更强。诱导出的CmFLS重组融合蛋白大小在43kDa左右，同时使用Ni-NTA树脂纯分离纯化出重组融合蛋白，并确定使用含250mM咪唑的Ni-Native Buffer洗脱效果最好，将纯化后的重组融合蛋白进行体外催化反应，然后将反应的产物萃取后进行HPLC分析，结果显示CmFLS重组融合蛋白在特定缓冲液及反应条件下能够将二氢槲皮素催化生成槲皮素，表明CmFLS编码的功能性蛋白在杭菊黄酮生物合成途径中具有双加氧酶活性。