Hippo信号通路参与多种生物学过程,如胚胎发育、器官大小调控、成体干细胞维持、天然免疫调节、肿瘤发生发展。该通路已经成为生命科学研究的热点方向。Hippo通路最早于2003年在果蝇中通过EMS介导的突变体筛选被发现,后续的研究发现,该通路再进化中高度保守。Hippo通路的失调会导致多种人类疾病,甚至肿瘤发生。探究Hippo通路活性调控机制,对于理解发育、肿瘤发生,都具有重要意义。果蝇中,Hippo通路通过一系列激酶偶联反应将信号传递给辅助转录因子Yki,调控Yki蛋白的磷酸化和亚细胞定位。当Hippo通路处于活化状态,激酶Hpo和Sav形成具有活性的复合体,磷酸化下游激酶Wts,Wts被激活。激酶Wts和Mats形成复合体,磷酸化下游的转录辅助因子Yki。磷酸化的Yki在细胞质中于微管相关蛋白14-3-3结合,滞留在细胞质,无法进入细胞核发挥转录活性。当Hippo通路失活,Yki的磷酸化被解除,非磷酸化的Yki蛋白进入细胞核,和转录因子Sd结合,共同激活下游靶基因表达。我们最新的研究也显示,Hippo通路不仅调控Yki的磷酸化和亚细胞定位,也调控Yki蛋白的稳定性。Hippo通路抑制Yki与去泛素化酶Usp7结合,解除Usp7对Yki蛋白的保护作用,促进Yki蛋白泛素化降解。因此,Hippo通路通过双重机制抑制Yki活性。由此可知,Yki处于该信号通路关键位置。Yki作为转录辅助因子,并没有结合DNA能力。Yki调控下游靶基因表达的机制至今尚不清楚。此外,有研究显示,Yki蛋白富集在基因的启动子和增强子区域,暗示Yki不仅扮演转录辅助因子功能,还起转录增强功能。探究Yki在Hippo通路中的功能,对深入理解Hippo信号转导机制,具有重要意义。Kto是转录辅激活子Mediator中的一个重要亚基,它是一个多亚基复合物,能够招募RNA聚合酶II启动基因表达。Mediator复合物可以直接与RNA聚合酶II结合,并将其招募至靶基因的启动子上,其中的许多亚基能作为受体识别许多转录因子,将这些特定的转录因子与Mediator结合起来从而激活基因的转录。Mediator中包含四个重要组成本分,分别是头部、中部、尾部和激酶活性中心。其中激酶活性中心是我们的主要研究对象,包含四个亚基,分别是Kto、Skd、CDK8和Cyc C。通过遗传筛选,我们发现敲除Mediator复合体原件Kto、Skd导致果蝇翅和眼睛显著变小。进一步的免疫荧光染色显示,敲降Kto、Skd下调Yki靶基因表达。在果蝇成虫翅膀和眼睛中特异性敲降Kto会导致器官变小,同时在果蝇幼虫翅原基中的P区特异性敲降Kto使Hippo信号通路下游靶基因diap1和bantam(ban)表达水平显著降低且P区面积明显变小。Skd、CDK8和Cyclin C的特异性敲降也会导致果蝇器官的发育不良以及靶基因表达水平降低。接下来,通过遗传学表位分析发现Kto作用于辅助转录因子Yki上游或平行于Yki的位置。通过原核诱导表达、注射小鼠等实验获得Kto抗体,我们对果蝇的S2细胞进行免疫荧光染色,发现Kto定位于细胞核中。此外,免疫共沉淀(Co-IP)实验发现Kto与Yki间存在蛋白-蛋白间的相互作用,且这一机制在哺乳动物中是保守的。接下来我们通过Co-IP实验证明了Kto与Sd不存在蛋白互作,且这一机制在哺乳动物中也是保守的。因此我们认为Kto及其他亚基不直接作用于转录因子Sd,而是通过其他媒介调控转录的。综上所述,我们发现Mediator在Hippo信号靶基因表达中,起着不可或缺的作用。Yki蛋白可能通过招募Mediator复合体,招募RNA聚合酶II至基因启动子或增强子区域,促进下游基因表达。本研究暗示这Yki在Hippo信号传到中起着桥梁因子作用,其介导转录因子Sd与RNA聚合酶II结合,激活下游靶基因表达。我们的研究揭示了Yki在Hippo信号转导中的作用机制。但是,Yki蛋白如何协调Sd与RNA聚合酶II结合,Yki结合Kto的区段,还需要进一步探究。Hippo信号通路功能障碍是一些人类发育异常和疾病的基础,使其成为重要的治疗靶点。我们发现了Kto及其他复合体亚基协同参与调控Hippo信号通路的稳态,为进一步探究辅助转录因子Yki的功能提供了有力依据。本文的研究为疾病的预防与治疗提供了理论思想,具有重要意义。