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自2003年我国爆发了非典型肺炎疫情以来,作为其病原体的SARS冠状病毒受到了全球医学和生物学研究领域的高度重视。在过去的五年时间里,人们对于SARS冠状病毒已经有了较为全面的了解,包括SARS冠状病毒的全基因组解序和其功能蛋白质的分析。然而,有关SARS冠状病毒高度传染的分子机制仍然知之寥寥。探索SARS冠状病毒蛋白质的生物化学性质以及它们和感染宿主之间的关系是解开该病毒作用机制的重要研究方向。
SARS冠状病毒的核壳蛋白(N蛋白)是该病毒所能表达的最高丰度蛋白质。一般认为,冠状病毒N蛋白的磷酸化可促使核蛋白复合体的形成,以稳定病毒基因组RNA。然而,SARS冠状病毒的N蛋白是否存在着磷酸化现象一直有所争论。本论文试图通过系统研究真核细胞内SARS冠状病毒N蛋白的磷酸化状态,为深入了解SARS冠状病毒的转录调控机制提供一个新的研究方向。我们对SARS冠状病毒N蛋白的磷酸化可能性进行了生物信息学分析,同时参照了其他冠状病毒N蛋白磷酸化的报道,提出了本项研究的基本假设,即SARS冠状病毒N蛋白是一个磷酸化蛋白质。
通过比较大肠杆菌、酵母细胞和哺乳动物细胞中表达的SARS冠状病毒N蛋白的双向电泳图谱,我们发现,真核细胞中表达的N蛋白在电泳图谱上呈现多重等电点的串状斑点,而原核细胞中表达的N蛋白仅呈现单个斑点。真核细胞表达的SARS冠状病毒N蛋白经碱性磷酸酶处理后,串状斑点的数目显著下降,并移向碱端;而原核细胞表达的SARS冠状病毒N蛋白经蛋白激酶处理后,电泳斑点的数目增加,并移向酸端。SARS冠状病毒N蛋白的电泳行为清楚地提示,它的确为一个可磷酸化的蛋白质。
SARS冠状病毒N蛋白的大部分潜在磷酸化位点均位于180-210aa区域,而这一区域还存在大量的胰蛋白酶作用位点。这种结构特点可能造成磷酸化位点检测的困难性。我们采用部分胰蛋白酶水解的方法,利用ESI/MS测定未完全酶解的N蛋白肽段,发现了Ser184、Ser188、Ser189、Ser191、Ser195、Ser198和Ser203为磷酸化位点。为了进一步确证质谱分析的结果,我们运用分子生物学技术,表达截断N蛋白片段(the truncated N fragments)或者在N蛋白的磷酸化区域中将精氨酸残基突变,然后采用双相电泳、ESI/MS和胰蛋白酶水解等方法分析N蛋白的肽段。这些测定结果与部分胰蛋白酶水解的数据基本吻合。这样,我们首次证实,SARS冠状病毒N蛋白上存在着一个富含丝氨酸而且能够被磷酸化的区域(denseserine island)。我们推测,当SARS冠状病毒感染宿主细胞时,其N蛋白是宿主细胞蛋白激酶的底物,可形成的多重磷酸化产物。
我们对SARS冠状病毒N蛋白磷酸化的功能进行了初步的探索。利用免疫化学测定技术,我们比较了大肠杆菌和酵母细胞中表达的SARS冠状病毒N蛋白的免疫活性,发现磷酸化SARS冠状病毒N蛋白具有更好的免疫原性。利用蛋白质亲和分离和质谱相结合的方法,我们试图分离和鉴定与N蛋白有相互作用的蛋白质,从而寻找体内N蛋白适合作为何种蛋白激酶的底物。结果表明,在酵母细胞对N蛋白具有较强亲和性的蛋白质中,casein kinase2和一个拟蛋白激酶(gi|1143567),可能是SARS冠状病毒N蛋白的蛋白激酶。