【摘 要】
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背景和目的:Meckel-Gruber综合征（Meckel-Gruber Syndrome,MKS,MIM615397）是一种罕见的常染色体隐性遗传病,由胚胎发生早期纤毛功能障碍引起。MKS是纤毛病最为严重的表型,其临床表型主要为枕后脑膨出、轴后多指、多囊肾及肝脏发育异常,多在胎儿期或新生儿期死亡。目前,研究发现至少有21个基因变异与MKS相关,其中于2013年首次发现Transmembrane
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背景和目的:Meckel-Gruber综合征（Meckel-Gruber Syndrome,MKS,MIM615397）是一种罕见的常染色体隐性遗传病,由胚胎发生早期纤毛功能障碍引起。MKS是纤毛病最为严重的表型,其临床表型主要为枕后脑膨出、轴后多指、多囊肾及肝脏发育异常,多在胎儿期或新生儿期死亡。目前,研究发现至少有21个基因变异与MKS相关,其中于2013年首次发现Transmembrane protein 231（TMEM231）基因变异可导致MKS。TMEM231基因位于16号染色体16q23.1,编码一种两次跨膜蛋白,参与初级纤毛过渡区的MKS复合体的组成。该复合体位于纤毛基底部并作为一种屏障阻止纤毛和质膜之间蛋白的扩散,参与纤毛膜形成及纤毛信号通路转导。TMEM231基因突变会破坏MKS复合体的形成,进而产生MKS临床表型。本研究对一个多次妊娠均发现胎儿枕后脑膨出等表型的家系进行全外显子组测序（Whole-exome sequencing,WES）,发现患病胎儿存在TMEM231基因复合杂合变异,可能是导致该家系反复不良妊娠的致病原因;变异位点致病性未见报道,我们拟就发现的变异位点进行体外研究以证实其致病性,初步探索其致病机制,为MKS遗传咨询及产前诊断提供理论依据。研究方法:1.对一例初步诊断为Meckel-Gruber综合征的引产胎儿组织及其父母外周血进行全外显子组测序。2.对发现的TMEM231基因的两个剪接位点变异（c.583-1G＞C和c.583-2＿588delins TCCTCCC）进行Sanger测序验证。3.采用RT-PCR及TA克隆测序分析TMEM231基因变异对m RNA剪接的影响。4.采用q PCR技术研究MKS胎儿肾脏、心脏和肝脏组织中TMEM231基因的表达水平。5.采用石蜡包埋技术对MKS胎儿和正常对照胎儿肾脏和肝脏组织进行包埋固定及石蜡切片,使用HE染色技术对MKS胎儿及正常对照胎儿肾脏进行组织病理学分析。6.采用免疫荧光技术,使用ARL13B抗体（纤毛标记物）标记纤毛后用共聚焦显微镜进行拍照观察,研究TMEM231基因变异对人类肾脏纤毛的影响。结果:1.MKS胎儿组织全外显子组测序结果提示TMEM231基因两处变异:c.583-1G＞C和c.583-2＿588delins TCCTCCC剪接位点复合杂合变异。变异分别来自于父亲、母亲;两个变异数据库均尚未见报道,依据ACMG的分级属于致病性变异（PVS1+PM2+PP4）。2.TA克隆测序证实c.583-1G＞C及c.583-2＿588delins TCCTCCC两个剪接位点变异均导致外显子5跳跃（c.583＿664del）的缺失移码,在第195位氨基酸处引起移码并于第199位氨基酸提前形成终止密码子。3.q PCR证实MKS胎儿的肾脏、肝脏及心脏组织中TMEM231基因表达较正常对照胎儿显著降低（P＜0.05）。4.MKS胎儿肾脏组织HE染色显示:局部肾皮质和髓质可区分,部分肾小球分化,可观察到大小不一的囊样结构;肝脏组织HE染色未见明显异常。5.免疫荧光技术证实MKS胎儿肾脏ARL13B（纤毛标记物）的表达显著减少,肾小管上皮的初级纤毛几乎消失。结论:1.TMEM231基因c.583-1G＞C及c.583-2＿588delins TCCTCCC剪接位点变异是该家系反复孕育MKS患者的病因。2.数据库及文献检索表明TMEM23 c.583-1G＞C及c.583-2＿588delins TCCTCCC变异均为首次报道;两变异位点均产生了异常剪接使82bp的碱基缺失导致转录本阅读框发生移码,并在199位氨基酸处提前出现终止密码子。3.在MKS患者肾脏、肝脏和心脏组织中,TMEM231表达水平降低;TMEM231基因变异使MKS患者的肾小管上皮具有纤毛的细胞显著减少,是导致其多囊肾表型的原因。
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