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机体的抗肿瘤免疫主要为T淋巴细胞所介导，其中CD8+细胞毒T淋巴细胞（CTLs）及CD4+Ⅰ型辅助T细胞（Th1cells）介导的I型适应性免疫应答是抗肿瘤免疫的基础。T-bet和Eomes是调控CD4+Th1cells和CD8+CTLs等I型效应T细胞分化和功能的重要转录因子。已有研究表明，肿瘤患者的生存期与转录因子T-bet和Eomes表达密切相关：肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中T-bet和Eomes表达水平高的癌症患者生存期显著延长。最近的研究结果显示T-bet和Eomes在由CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中发挥重要调节作用，但其中涉及的机制，各家报道不一。免疫记忆是适应性免疫应答的重要特征之一。记忆T细胞是一具有异质性的群体，主要可以分为三个不同的亚群：效应性记忆T细胞(effector memoryT cell，TEM)、中枢性记忆T细胞(central memory T cell，TCM)和干细胞样记忆T细胞(T memory stem cells，TSCM)。已有报道，T-bet和Eomes参与效应T细胞和记忆T细胞功能及分化的调节，但两者对干细胞样记忆T细胞(TSCM)的作用尚不清楚，有待进一步探讨。此外，既往的研究主要集中于T-bet和Eomes在淋巴器官中对T细胞的作用，然而T-bet和Eomes在炎症组织（包括癌组织）中对CD8+T细胞分化和功能的作用及确切的机制尚未阐明。IL-1家族成员IL-33在细胞坏死过程中被释放到组织微环境中，发挥危险信号的作用从而促进炎症反应。本课题小组前期研究发现，T-bet和Eomes参与调控CD8+T细胞表面IL-33受体ST2的表达。鉴此推测，T-bet和Eomes通过调控IL-33／ST2信号转导增强CD8+效应T细胞在炎症组织中的功能。针对上述未解决的科学问题，本论文开展了以下研究：第一部分T-bet和Eomes对CD8+记忆T细胞亚群形成及其抗肿瘤作用的调控【目的】研究过继性移植后，转录因子T-bet和Eomes对受者体内记忆T细胞亚群形成以及记忆T细胞抗肿瘤效应的调控作用。【方法】自B6-LY5.2/Cr小鼠皮内接种3×105B16F0黑色素瘤细胞，移植6天后小鼠接受非致死剂量辐照，24小时后移植5×105经Th1条件下诱导培养3天的WT, T-bet/（TKO）, Eomes/（EKO）或者T-bet/Eomes doubly deficient（DKO）pmel-1-T细胞，建立过继性移植荷瘤动物模型，隔日测量并记录肿瘤生长情况。为分析过继性移植T细胞在预防肿瘤生成中的作用，B6-LY5.2/Cr小鼠接受非致死剂量辐照，24小时后移植4×106经Th1条件下培养4天的WT, T-bet/, Eomes/或者T-bet/Eomes DKO pmel-1-T细胞，1个月后各组小鼠均皮内注射2×105B16F0黑色素瘤细胞，隔日测量记录肿瘤生长情况。自各组小鼠的脾脏、淋巴结以及实体瘤组织中分离获得单细胞悬液，并通过流式细胞检测技术检测细胞上CD44，CD62L等表面分子以及IFN-γ和IL-17等胞浆内细胞因子的表达水平，进一步分析T-bet和Eomes在CD8+记忆T细胞各亚群形成中的作用以及T-bet和Eomes对记忆T细胞抗肿瘤效应的作用。【结果】（1）移植了WT, TKO或者EKO pmel-1-T细胞的小鼠肿瘤生长得到抑制，然而DKO pmel-1-T细胞无法抑制肿瘤的生长；（2）荷瘤小鼠接受移植20天后，在淋巴结中，与WT pmel-1-T细胞相比，TKO pmel-1-T细胞占淋巴细胞的比例显著上调，而在肿瘤浸润的淋巴细胞中，TKO、EKO和DKO pmel-1-T细胞所占比例均显著下降，这其中DKO pmel-1-T细胞下降最为显著。在脾脏中，与WT-T细胞相比，IFN-γ阳性的EKO pmel-1-T细胞比例下降，IFN-γ阳性的TKO和DKO pmel-1-T细胞比例显著下降。这其中DKO pmel-1-T细胞下降最为显著；（3）在过继性移植30天后，与WT、TKO和EKO基因型pmel-1-T细胞相比，DKO pmel-1-T细胞中CD44low记忆T细胞的比例显著上调，且这群细胞表型特征为CD44lowCD62LhighSca-1+，与干细胞样记忆T细胞特征一致；（4）在过继性移植T细胞预防肿瘤生长实验中，本研究发现WT, TKO和EKO pmel-1记忆T细胞可以抑制肿瘤细胞生长，但DKO记忆T细胞则无类似作用；（5）WT, TKO, EKO以及DKO四种不同基因型的pmel-1记忆T细胞在肿瘤抗原再次激发后，增殖能力不存在差异，提示T-bet和Eomes可能参与调控记忆T细胞的功能，而对其增殖能力没有直接影响。【结论】本研究发现小鼠过继性抗肿瘤免疫治疗依赖于转录因子T-bet和Eomes，证实转录因子T-bet和Eomes对于效应性和中枢性记忆T细胞具有重要作用。此外，发现同时敲除T-bet和Eomes可以促使一群CD8+干细胞样记忆T细胞群体产生，表明T-bet和Eomes在调控效应／中枢性记忆T细胞与干细胞样记忆T细胞之间的平衡中发挥协同作用。第二部分IL-33/ST2途径在T-bet调控下协同IL-12信号促进CD8+T细胞功能的作用和机制【目的】分析T-bet/Eomes对CD8+T细胞中ST2表达的调控作用，并探讨IL-33/ST2信号对CD8+T细胞效应功能的作用及可能机制。【方法】从C57BL/6WT, Tbet/, Eomes/, T-bet/Eomes DKO小鼠的脾脏和淋巴结中分离获得单细胞悬液。通过流式分选或者磁珠分选获得CD62L+CD44CD8+初始（Na ve）T细胞，经anti-CD3以及anti-CD28抗体包板刺激细胞，或以去除T细胞并接受辐照的脾脏细胞作为抗原提呈细胞，联合anti-CD3抗体刺激，在Tc0、Tc1、Tc2和Tc17条件下，使用RPMI-1640完全培养基培养细胞。CD8+pmel-1-T细胞则经1μM gp10025-33联合抗原提呈细胞刺激，分别在Tc0、Tc1、Tc2和Tc17条件下培养4天。收获各亚型CD8+T细胞通过流式细胞仪以及Real-TimePCR仪检测CD8+效应T细胞上ST2的表达，分析T-bet／Eomes在ST2表达中的作用。利用体外实验进一步分析IL-33协同IL-12以及anti-CD3抗体对Tc1细胞生物学功能的影响及相关作用机制。【结果】（1）Tc1条件下培养的CD8+T细胞上ST2mRNA高表达。与其它极化培养条件下的细胞相比，而Tc2条件下培养的CD8+T细胞上ST2mRNA的表达水平最低，TCR信号可以进一步增强Tc1细胞上ST2的mRNA水平;（2）Tc1细胞上ST2的表达主要依赖于转录因子T-bet，但转录因子Eomes似乎不参与调控细胞上ST2的mRNA水平;（3）IL-33在TCR和（或）IL-12信号协同作用下可显著促进Tc1细胞分泌IFN-γ，而上述协同作用依赖于T-bet;（4）IL-33协同IL-12可以显著上调Tc1细胞上IFN-γ，T-bet以及Blimp1的mRNA水平，下调TCF-1和LEF-1的mRNA水平;（5）敲除Gadd45b基因可以下调Tc1细胞中p38蛋白磷酸化水平以及IL-12协同IL-33诱导的IFN-γ mRNA水平。而p38抑制剂几乎可以完全抑制IL-12协同IL-33对IFN-γ表达的作用。【结论】本研究发现Tc1效应T细胞上高表达IL-33的受体ST2，并受T-bet调控。证实IL-33/ST2途径协同IL-12信号以Gadd45/p38依赖机制，促进Tc1型免疫应答。