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目的:低级别胶质瘤（LGG）是颅内最常见的恶性肿瘤,在生物学行为和分子特征上有很大的异质性。尽管目前对于LGG采用了手术切除、化疗和放疗等综合治疗方法,但耐药性以及肿瘤复发仍然不可避免,一些肿瘤甚至发生进展成为高级别的胶质母细胞瘤,预后极差。因此,对于LGG病人新的治疗靶点及预后相关的生物标志物的研究引起了高度的关注。ARF家族是一种小分子GTP酶,是Ras超级家族中的分支,在很多真核生物中都有ARF家族的存在,分子结构高度保守。ARF蛋白家族结合GTP可以使其激活,而GTP水解后又迅速失活;激活可以被GEF因子调控,而GAP可以调控其失活,激活后的ARF和效应分子结合,介导下游的细胞功能活动。ARF家族对细胞活动有着非常重要的影响,广泛参与到跨膜运输、纤毛形成、脂质代谢、能量代谢、细胞运动、凋亡及转录调节活动中。很多研究已经发现肿瘤细胞可以破坏调控跨膜物质运输的分子从而增强自身的迁移和侵袭能力。研究显示ARL分子,作为ARF家族的成员,在肿瘤的发生和进展中也发挥着重要作用。但是目前ARL9相关的研究报道很少,其在胶质瘤中的生物学特性仍未知。本研究中,我们首先利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析ARL9的m RNA在癌组织和正常组织中的差异表达情况,并且查看ARL9的表达与ARL9的DNA甲基化关系,同时评估ARL9的表达和甲基化对LGG预后的影响。接着我们在中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）数据库、Gravendeel数据集以及Rembrandt数据集中进一步验证ARL9对预后的作用,同时,我们对四个独立数据集的结果进行meta分析来全面评估ARL9的总体预后情况。为了探索ARL9影响LGG的潜在机制,我们利用多种反卷积计算方法来查看ARL9表达对免疫微环境的作用,并且通过基因富集分析探索ARL9涉及的分子通路机制。最后通过RT-PCR和Western blot检测临床上收集到的LGG肿瘤组织和正常脑组织中ARL9的表达情况。方法:TCGA数据库分析及多个独立数据集验证首先利用ARL9在TCGA数据库中的m RNA表达数据分析其在LGG和正常脑组织中的差异表达情况。再下载TCGA中的甲基化和临床数据分析ARL9的表达与ARL9甲基化位点之间的关联,以及对预后的影响,同时分析ARL9表达和常见临床特征（包括年龄、性别、病理类型、WHO分级以及1p19q缺失和IDH1突变等）的关系。然后我们先在中国胶质瘤CGGA数据库中验证上述差异表达、甲基化情况、以及和预后、临床特征的关联,再在另外两个独立的Gravendeel和Rembrandt数据集中重复观察ARL9表达与预后的联系。ARL9对预后影响的Meta分析检索Pub Med、Web of Science和Embase数据库中ARL9相关的文献。英文检索词为（“ARL9”or“ADP-ribosylation factor-like 9 protein”）and（“glioma”or“astrocytoma”or“ependymoma”or“oligodendroglioma”or“glioblastoma”）,提取所有ARL9和预后相关的文献。由于文献检索未发现任何相关的研究,因此我们通过对本研究的四个独立数据集中ARL9对预后的影响进行meta分析,计算总的风险比值（HR）和95%可信区间（95%CI）来评估ARL9对LGG预后的影响。采用Q检验（I2值）来检验四个数据集的异质性。当I2小于50%时,可以认为四个数据集之间没有明显异质性,采用固定效应模型;否则,采用随机效应模型。ARL9表达对免疫微环境的改变以及分子机制的探究利用CIBERSORT、TIMER、quan TIseq、EPIC和XCELL等算法计算不同数据集中每个LGG患者肿瘤组织中的免疫细胞含量,分析ARL9高表达和低表达组中各种免疫细胞的浸润情况;同时对ARL9高表达组和低表达组进行差异分析,寻找和免疫相关的差异基因,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,然后基于关键的差异免疫基因构建免疫评分和生存模型来预测LGG患者的预后。临床胶质瘤标本中检测ARL9的表达应用PCR法检测12例胶质瘤（II级胶质瘤8例,III级胶质瘤4例）和12例对照脑组织（5例癌旁组织以及7例正常脑组织）中的m RNA水平,同时利用Western Blot法检测这些组织中的蛋白水平,然后比较胶质瘤组中和对照脑组织中的m RNA以及蛋白的表达差异。统计分析数据分析使用R语言（version 3.6.3）和Graph Pad Prism（version 6.0）。ARL9高表达和低表达分组是根据各数据集中的中位值进行划分的。同时,根据TCGA-LGG数据集中ARL9的DNA甲基化中位值将ARL9高甲基化组合低甲基化组。分类变量统计采用卡方检验或Fisher检验,连续变量采用t检验或非参数检验,ARL9表达和甲基化的关联使用Person系数,ARL9表达和预后关系采用Kaplan-Meier曲线以及单因素和多因素COX分析。ARL9对预后的预测使用ROC曲线评估。双侧检验P值小于0.05认为有统计学意义。结果:ARL9的表达和与预后相关,ARL9的启动子甲基化与ARL9表达成负相关,且ARL9与肿瘤复发、1p19q缺失、IDH突变有关;通过挖掘TCGA数据库,表明ARL9的m RNA表达在LGG肿瘤组织中较低,而正常脑组织中较高。另外,甲基化数据分析显示ARL9的DNA甲基化和ARL9表达和有明显的负相关,并且ARL9的低表达或高甲基化预示着好的预后,而且ARL9的表达及甲基化和肿瘤复发、1p19q缺失、IDH突变状态有关。在CGGA数据库的分析中再次验证了ARL9和预后以及临床特征的相关关系。另外,在Rembrandt和Gravendeel两个独立的数据集中同样发现ARL9和预后相关的一致性结论。最后综合文献检索及四个独立数据集的meta分析中发现ARL9的低表达对预后有益,且ARL9可以很好地预测LGG患者5年总体生存率。ARL9高表达时免疫微环境中的CD4+T细胞、CD8+T细胞减少,同时Tregs、MSDCs、M2型巨噬细胞增多;同时ARL9主要影响T细胞相关的功能和通路。我们在CIBERSORT、CPIC、quan TIseq、TIMER四种算法以及三个不同数据集中还是观察到了比较一致的结果:ARL9高表达时,肿瘤微环境中的髓样树突细胞、M2型巨噬细胞、Tregs、MDSC细胞增多;ARL9低表达时,CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、M1型巨噬细胞浸润增加。在ARL9和28中免疫细胞的表面标志物分析中,发现ARL9的表达和MDSC细胞、Treg细胞的表面标志物呈正相关,而与CD4+T细胞、CD8+T细胞的表面标志物呈负相关。对ARL9高、低表达组的差异基因进行GO和KEGG富集分析发现,ARL9主要作用于T细胞相关的功能和信号通路。ARL9在LGG肿瘤组织中低表达,在正常脑组织中高表达用实时定量PCR检测ARL9在LGG中的m RNA的含量,用Western blot检测ARL9在LGG中的蛋白表达,分别将其与正常脑组织的相比较,我们发现ARL的m RNA和蛋白均在肿瘤组织中低表达。结论:ARL9在LGG中低表达,且ARL9的甲基化会抑制ARL9的表达;ARL9低表达或高甲基化预示着好的预后,是重要的生物标志物;ARL9的表达可能对免疫微环境中CD4+T细胞、CD8+T细胞、MDSC细胞、小胶质细胞和Treg细胞的浸润有影响,使胶质瘤细胞处于免疫抑制状态;同时ARL9主要通过影响T细胞相关的功能和通路发挥作用。