【摘 要】
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第一部分脂质代谢在预测胃癌患者预后风险的探索目的:探究脂质代谢在胃癌与正常组织中的代谢差异,筛选出对胃癌预后有预测作用的直至代谢相关基因。方法:从KEGG网站筛选出204个脂代谢相关基因,分析来自公共数据库及华中科技大学同济医学院附属协和医院的胃癌队列共6个独立的数据集,总计1129个胃癌患者数据。其中TCGA数据库的一个队列作为训练集,4个来自GEO的独立队列进行外部验证,此外武汉协和医院的1个
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第一部分脂质代谢在预测胃癌患者预后风险的探索目的:探究脂质代谢在胃癌与正常组织中的代谢差异,筛选出对胃癌预后有预测作用的直至代谢相关基因。方法:从KEGG网站筛选出204个脂代谢相关基因,分析来自公共数据库及华中科技大学同济医学院附属协和医院的胃癌队列共6个独立的数据集,总计1129个胃癌患者数据。其中TCGA数据库的一个队列作为训练集,4个来自GEO的独立队列进行外部验证,此外武汉协和医院的1个队列进行免疫组化验证。对胃癌组织和正常组织进行差异和富集分析。此外,构建一个稳定的LASSO-Cox比例风险回归模型用来选择预后的预测基因,并构建基于该模型的基因图谱。结果:胃癌组织中醚脂代谢、甘油磷脂代谢、甘油脂代谢等脂代谢相关通路上调,脂肪酸β氧化、氧化还原过程、脂质氧化、氧化还原酶活性等通路较正常组织降低。由AGPAT3、AKR1B1、PLD1和UGT8组成的基因图谱显示,3组基因表达差异的患者总生存率有显著差异（HR=2.00,95%CI=1.54-2.59,p<0.001）。此外,剖面图和Schoenfeld个体试验图的鞅残差显示出平衡的危险比例。该基因图谱在一个GEO的独立集中得到了可靠验证（HR:1.48,95%CI:1.11-1.97,p<0.001）。此外,基因图谱在免疫组化队列中表现良好（HR:2.16,95%CI:1.42-3.31,p<0.001）。结论:脂质代谢在胃癌组织与正常组织间存在显著差异,基于此差异建立的一种新的基因图谱可以可靠的预测胃癌患者预后,提示了脂代谢在预测胃癌预后方面具有潜在的临床应用价值。第二部分PLD1调控游离脂肪酸代谢影响胃癌细胞的营养应激的机制研究目的:研究PLD1调控游离脂肪酸代谢影响胃癌细胞营养应激的临床意义及具体机制。方法:利用公共数据库和武汉协和医院患者数据,回顾性分析PLD1表达与胃癌患者预后的联系。应用小分子抑制剂验证营养胁迫条件下PLD1对胃癌细胞（SGC7901,BGC823,AGS）增殖能力的影响。利用慢病毒质粒载体构建PLD1稳定敲除PLD1的SGC7901细胞系,在体内实验验证PLD1敲除后对胃癌细胞移植瘤的增殖能力的影响。应用细胞流式,分析PLD1下调后线粒体的ATP生成情况,膜电位及ROS改变。用免疫荧光技术对脂滴,线粒体,自噬小体的共定位,验证PLD1下调后对胃癌细胞在营养胁迫条件下的脂质代谢转换的影响。通过游离脂肪酸高通量检测,分析PLD1下调后细胞内游离脂肪酸代谢的改变,通过q RT-PCR验证PLD1对PPARs通路的影响,以及其下游调控游离脂肪酸代谢的相关节点。进一步应用Western Blot验证靶向PLD1阻断自噬流的作用节点,并通过免疫荧光定位分析其阻断自噬流的位点及其机制。结果:回顾性分析结果显示PLD1表达水平与胃癌患者预后风险呈正相关。MTT结果显示在常规营养下PLD1下调会抑制胃癌细胞（SGC7901,BGC823,AGS）的增殖能力,在营养胁迫条件下,抑制效果更明显甚至引起胃癌细胞死亡。体内实验结果验证胃癌细胞移植瘤模型中PLD1下调后移植瘤的生长受限。应用细胞流式实验检测营养胁迫条件下,PLD1下调后ATP生成水平持续降低,线粒体ROS提前升高,但线粒体膜电位不受影响,而外源性添加能源物质可以恢复细胞增殖能力。通过免疫荧光实验发现,PLD1下调不影响脂滴与线粒体的接触及脂肪水解的功能,但自噬流激活后无法维持脂滴的正常体积大小。脂肪酸高通量测序显示PLD1下调后细胞内大量游离脂肪酸积累,且总量随时间变化不大,显示脂肪酸代谢受阻。q RT—PCR结果显示PPARα通路的激活受到限制,应用PPARα小分子激活剂可以恢复一部分PLD1对细胞增殖的抑制表型。Western Blot结果显示自噬流被阻断,但m TOR通路不受影响,免疫荧光显示PLD1下调后溶酶体的体积大小明显增加,PLD1与氯喹对溶酶体的影响类似,二者联用不能增强该效果。结论:PLD1的表达水平与胃癌预后相关,PLD1的活性使胃癌细胞维持生物学行为所必需的。PLD1通过作用于PPARα/ACSLs通路影响游离脂肪酸氧化,同时通过干扰溶酶体功能阻断自噬从而影响游离脂肪酸来源干扰了游离脂肪酸代谢的平衡,使细胞代谢可塑性降低。
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