目的：膀胱癌与所有恶性肿瘤形成过程相似，其生长和转移也依赖于新生血管的生成。肿瘤的血管生成受多种血管生成因子的调控，其中血管内皮生长因子（VEGF）家族及其受体是目前已知的最强的、特异性作用于内皮细胞的生长因子，在肿瘤的血管生成中起着重要的作用。已有相关研究表明，KDR在血管内皮细胞和多种肿瘤细胞上特异性表达，本项目的前期研究也已证实膀胱移行细胞癌组织VEGF和KDR的表达阳性率分别为88%（53/60）和85%（51/60），且随着肿瘤病理分期和细胞分级的增高其表达水平上调。本研究通过构建sKDR的原核表达载体，探讨其对血管内皮细胞增殖的影响。方法：首先以人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）cDNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到sKDR cDNA片段，并构建重组pQE40-sKDR表达质粒。将pQE40-sKDR重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15进行sKDR蛋白的诱导表达及纯化后，分别应用体外细胞培养法和鸡胚体内培养法对sKDR蛋白对脐静脉血管内皮细胞的增殖抑制效应进行分析。结果：以HUVEC cDNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到sKDR cDNA片段（大小为2238bp），并应用该片段成功构建重组质粒pQE40-sKDR。将构建的pQE40-sKDR重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15进行sKDR蛋白的诱导表达及纯化，并应用Western blot方法得到验证。应用MTT法分别采用不同浓度的sKDR蛋白与HUVEC进行增殖抑制实验发现，加入sKDR蛋白后可抑制血管内皮细胞的增殖，且随sKDR蛋白浓度的增加而增强。应用VEGF与sKDR蛋白加入HUVEC培养液中可明显抑制HUVEC增殖；同时通过鸡胚体内培养发现，加入sKDR蛋白后可明显抑制鸡胚尿囊膜血管形成，与PBS组和VEGF组相比，血管密度显著降低。结论：以KDR为靶点、针对KDR胞外区第1~4结构域编码序列成功了构建sKDR的原核表达载体。通过体外细胞培养证实，sKDR蛋白对人脐静脉血管内皮细胞的增殖具有明显的抑制作用，而且其抑制效应随sKDR蛋白浓度的增加而增强；sKDR可通过竞争性与VEGF结合而抑制了VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖；通过鸡胚体内培养证明，sKDR蛋白亦可明显抑制VEGF刺激而引起的鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成。目的：在成功构建sKDR的原核表达载体并通过体内体外实验证实其对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有明显的抑制效应的基础上，进一步利用sKDR的真核分泌型表达载体，通过体外体内实验探讨其对VEGF及人膀胱癌T24细胞的抑制作用，希望能利用sKDR与VEGF的高亲和力，从而阻断VEGF/KDR信号传导途径，达到抑制肿瘤血管形成和遏制肿瘤生长的目的，为膀胱癌的生物靶向治疗提供研究依据。方法：在成功建立sKDR原核表达载体的基础上，进一步利用其真核分泌型表达质粒pCI-sKDR转染人膀胱癌T24细胞，同时设立pCI-neo T24细胞和普通T24细胞为对照组。应用ELISA法对sKDR转染的人膀胱癌T24细胞与rhVEGF的结合活性进行检测；利用半定量RT-PCR方法对sKDR转染的人膀胱癌T24细胞KDR mRNA表达状况进行分析；应用流式细胞技术对sKDR转染的人膀胱癌T24细胞的细胞周期及凋亡情况进行检测；应用RT-PCR方法和Western-blot方法对sKDR转染的人膀胱癌T24细胞的VEGF及VEGF/KDR传导通路下游途径中与血管内皮细胞生长凋亡及血管生成密切相关的MMPs（包括MMP2、MMP9）、BAX、Bcl-2基因的表达状况分别在mRNA水平和蛋白水平上进行评价。应用MTT法对sKDR转染的人膀胱癌T24细胞的增殖能力及其对HUVEC的增殖能力的影响进行检测；最后应用sKDR转染的人膀胱癌T24细胞接种于裸鼠背部皮下组织内，并在接种后第7、14、21和28天监测肿瘤大小，并于第28天处死小鼠对肿瘤质量和体积进行比较。结果：pCI-sKDR T24细胞培养上清液与rhVEGF165蛋白结合活性与稀释倍数（在1:1-1:16稀释范围内）成正相关，而pCI-neo T24细胞和普通T24细胞的培养上清液与VEGF无结合力。pCI-sKDR T24细胞KDR mRNA表达水平与-actin的比值（0.665）与pCI-neo T24细胞和未转染细胞（均为0.160）相比升高了4.16倍（P<0.01）。与普通T24细胞和pCI-neo T24细胞相比，pCI-sKDR T24细胞增殖能力明显下降（分别下降了61.2%和55.1%）（P<0.01）；pCI-sKDR T24细胞的细胞周期明显被阻滞在G0/G1期，同时S期细胞比例减少（P<0.01）。pCI-sKDR T24细胞在G1期之前出现一个亚二倍体的细胞凋亡峰，凋亡细胞占全部检测细胞的12.7%；无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上，pCI-sKDR T24细胞MMP2、MMP9及Bcl-2基因的表达均明显减弱，BAX基因的表达均明显增强；加入pCI-sKDR T24细胞培养上清液对HUVEC的增殖（53.6%）具有明显的抑制作用（HUVEC增殖能力分别下降了46.4%和41.6%）（P<0.01）。裸鼠体内成瘤实验显示，普通T24细胞组和pCI-neo T24细胞组在接种后第7天即可发现肿瘤，而pCI-sKDR T24细胞组在接种后第13天才检测到肿瘤，与普通T24细胞组和pCI-neo T24细胞组相比，pCI-sKDR T24细胞组肿瘤生长速度较缓慢。于第28天时处死裸鼠取肿瘤称重并计算肿瘤体积，普通T24细胞组肿瘤重量为1.07±0.21g，体积为1.589±0.181cm3；pCI-neo T24细胞组肿瘤重量为0.91±0.19g，体积为1.283±0.05cm3；pCI-sKDR T24细胞组肿瘤重量为0.42±0.16g，体积为0.344±0.167cm3。28天时，与未转染组及pCI-neo组相比，pCI-sKDR组瘤重及瘤体积均显著偏小(P<0.01)。结论：sKDR转染的的人膀胱癌T24细胞可稳定表达KDR mRNA及蛋白，其表达产物与rhVEGF具有高结合活性，而普通T24细胞和pCI-neo T24细胞虽也可表达一定的KDR产物，但其与VEGF之间无明显结合活性。与普通T24细胞和pCI-neo T24细胞相比，稳定表达sKDR蛋白的人膀胱癌T24细胞的增殖能力明显减弱，凋亡速度明显加快。通过对VEGF/KDR相关通路血管生成/凋亡基因及蛋白的分析，间接表明被转染且可在人膀胱癌T24细胞中稳定表达的sKDR能通过与VEGF的结合而阻断下游传到通路上血管生成/凋亡信号的表达。稳定表达sKDR的人膀胱癌T24细胞在裸鼠体内具有良好的抑瘤作用。