研究背景心血管疾病是世界上无论是发展中国家还是发达国家中最常见的死亡原因之一,而这其中急性ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）首当其冲成为最为凶险、致死致残率最高的一类。虽然我国心血管疾病的预防和救治工作有了很大的改善,但急性心肌梗死的发病率及死亡率仍然在不断上升。再灌注治疗是STEMI患者最有效的治疗措施,可以向缺血区域提供及时有效的能量,从而减少梗死范围、维持心脏收缩功能。但是越来越多的基础和临床研究表明,缺血心肌在恢复血液再次灌注后会导致额外的心肌损伤,如心肌顿抑、心律失常、无复流、心肌坏死等的发生,这种现象称之为心肌缺血/再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury,MIRI）,MIRI 已成为影响再灌注治疗效果和STEMI患者预后的主要因素。既往研究MIRI的机制包括氧自由基学说、钙超载学说、心肌能量代谢障碍学说、细胞凋亡学说等;治疗策略包括非药物干预的方法如缺血预适应、缺血后适应和远程缺血预适应,药物干预方法包括腺苷、心房钠肽、环孢素A、极化液、胰高血糖素样肽-1等。虽然许多细胞实验、动物实验证实上述治疗措施有效,但转化成临床试验的结局确是令人失望的。单一的心脏保护策略对改善缺血再灌注损伤效果不佳,联合多种保护策略或者协同多靶点治疗却很有希望治疗缺血再灌注损伤,因此我们非常有必要进一步深入研究MIRI的分子机制,为我们探索新的诊断、治疗靶点提供依据。越来越多的证据表明缺血再灌注损伤的一种重要病理生理机制是细胞凋亡,细胞调亡是一个需要能量的过程,虽然冉灌注过程给缺血心肌提供赖以生存的氧气和能量,但同时也为细胞凋亡提供了能量。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase家族）在凋亡的执行阶段起主要作用,凋亡是多种Caspase共同完成的,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子促进凋亡过程中的终末剪切酶,有研究表明Caspsase-3在缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的内源性非编码单链小分子RNA,通过结合靶mRNA的3’ UTR区从而降解靶mRNA或抑制其翻译,达到调控基因表达的目的。miRNA在各种细胞功能调控中具有重要作用,例如胚胎发育、细胞凋亡、细胞生长和分化以及肿瘤发生等。研究表明在心血管系统方面,miRNA与心肌梗死、心脏肥大、心肌重塑、心力衰竭和心律不齐等各种心脏病的发病机制有密切关系。miRNA具有细胞和组织特异性,有快速释放的动力学特点,在血清当中相对稳定存在,因此循环miRNA有望用于心血管疾病的早期诊断、危险分层、判断预后甚至治疗。目前miRNA研究颇多,一些研究表明miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用,但在心肌缺血再灌注损伤中的研究仍不成熟。miR-26a-5p作为新近发现的一种miRNA,在多种心血管疾病中存在差异表达。如有研究显示经过miR-26a-5p抑制剂转染的冠心病小鼠模型,分离出的内皮细胞生存力明显下降而凋亡率明显升高。另一项研究表明miR-26a-5p的过表达可以减轻冠状动脉微循环栓塞引起的无复流和心肌坏死。鉴于心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡、冠脉微循环栓塞有着密切的关系,我们推测miR-26a-5p可能通过调节细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。目前,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。我们通过心肌细胞缺氧/复氧模型、小鼠缺血再灌注模型分别在体外、体内模拟了心肌缺血再灌注损伤模型。然后,利用生物实验结合生物信息学方法来探索miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤中的表达和调控作用,并进一步探讨miR-26a-5p影响缺血再灌注损伤可能的通路和机制,从而为更好的解释心肌缺血再灌注损伤的机制和提供可能的治疗策略奠定实验基础。第一章miR-26a-5p在缺氧/复氧心肌细胞中的表达及其调控作用目的关于心肌缺血再灌注损伤的分子机制仍未明确阐明,而关于miR-26a-5p在心肌缺血再灌注损伤当中的作用尚不清楚。第一章研究的目的是明确miR-26a-5p在细胞缺氧/复氧损伤中的表达水平,分析miR-26a-5p的过表达或抑制对缺血再灌注损伤程度的影响。方法1.生物信息学分析:从GEO数据库中搜索与心肌缺血再灌注相关的miRNAs的大数据,比较分析差异表达的miRNA。2.原代心肌细胞的分离和培养:取2日龄的C57BL/6乳鼠,消毒后开胸取心脏,分离出左心室后剪碎并胰酶消化,应用差速贴壁离心方法纯化心肌细胞,加入DMEM培养基,在37℃培养箱中培养。3.细胞转染:miR-26a-5p模拟物、miR-26a-5p抑制剂及相应对照物利用Lipofectamine█ RNAiMAX Reagent转染至原代心肌细胞中。4.建立心肌细胞缺氧/复氧模型:心肌细胞培养液置换为不含血清、不含糖的DMEM培养基,放置在37℃含5%C02、95%N2的低氧培养箱中缺氧培养4小时,之后置换上含糖、FBS的DMEM培养基并放置在37℃含95%空气和5%C02的培养箱中继续培养心肌细胞2小时,自此,缺氧/复氧（H/R）模型成功建立。5.细胞实验分组5.1实验一分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。5.2 实验二分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。6.MTT法检测心肌细胞活力:各组心肌细胞培养孔中加入MTT、二甲基亚砜后测定心肌细胞存活率。7.流式细胞学技术测定细胞实验中心肌细胞凋亡率。8.实时萤光定量PCR检测各组心肌细胞中miR-26a-5p含量。9.Western Blot实验检测促凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达。结果1.GEO网站为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/,识别出心肌缺血再灌注相关的miRNAs生物芯片数据,与正常组织对比,做差异分析。发现miR-26a-5p在心肌缺血再灌注组织中表达下调,差异明显（P=0.0004）。2.流式细胞学技术来检测H/R心肌细胞的凋亡率是12.65%,对照组心肌细胞凋亡率为0.71%,差异明显。Western Blot技术检测结果显示H/R心肌细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3的表达量明显高于对照组（P=0.0003）。3.qRT-PCR检测结果显示H/R心肌细胞中miR-26a-5p的含量明显低于对照组（P=0.0003）。4.转染miR-26a-5pmimic后心肌细胞中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染 miR-26a-5pinhibitor 后心肌细胞中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.0001）。MTT检测结果显示与对照组相比,过表达miR-26a-5p显著增加了心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力;miR-26a-5p表达受抑制后显著降低心肌细胞在缺氧/复氧后的细胞活力（P<0.01）。5.流式细胞学技术检测结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显著低于对照组,miR-26a-5p mimic组的细胞凋亡率为7.54%,mimic control组的细胞凋亡率为20.86%,差异明显;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞凋亡率显著高于对照组,miR-26a-5p inhibitor组的细胞凋亡率为35.89%,inhibitor control组的细胞凋亡率为23.25%,差异明显。Western Blot结果显示:过表达miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显著低于对照组;受抑制miR-26a-5p组H/R心肌细胞中cleaved caspase-3的含量显著高于对照组（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照组相比,miR-26a-5p在缺氧/复氧细胞中的表达明显下降;心肌细胞凋亡率明显升高。2.在缺氧/复氧心肌细胞模型中,miR-26a-5p的过表达可以通过降低心肌细胞凋亡率来减轻心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以通过增加心肌细胞凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。3.我们的研究结果可能有助于发现心肌缺血再灌注损伤中发生、进展的新机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段。第二章miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤目的miRNA是一类内源性非编码的单链小分子RNA,它通过结合靶基因mRNA的3’非翻译区,降解靶基因或抑制其翻译。miRNA具有功能多样性的特点,研究miRNA的靶基因功能较为复杂,近些年随着TargetScan、miRBase等大型miRNA分析数据库的发展,方便了科学家进行miRNA靶基因预测。我们在第一章的研究结果表明,miR-26a-5p在心肌缺血再灌注细胞中表达下调,且过表达miR-26a-5p可以减轻心肌缺血再灌注损伤,但具体机制尚不明确。本章目的是对miR-26a-5p的靶基因进行预测,研究miR-26a-5p调控心肌缺血再灌注损伤可能的通路机制并进一步验证。方法1.生物信息学分析:利用Targetscan数据库对miR-26a-5p的靶基因进行预测（http://www.targetscan.org/vert₇2）。2.利用双萤光素酶报告基因检测验证miR-26a-5p与PTEN的3’UTR是否存在互补结合关系。我们构建PTEN野生型和突变型的双萤光报告载体pMIR-REPORTTM-PTEN-WT和pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut,分别与 miR-26a-5p 模拟物（miR-26a-5pmimcs）以及阴性对照共同转染心肌细胞,观察各组萤光素酶活性的变化,从而验证PTEN是否是miR-26a-5p的靶基因。3.细胞培养、转染miRNA以及模拟缺氧/复氧模型（H/R）:同第一章。4.细胞实验分组:4.1实验一分组:萤光素酶报告基因检测1.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miR-26a-5p mimics 组。2.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-WT+miRNA control 组。3.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miR-26a-5p mimics 组。4.转染 pMIR-REPORTTM-PTEN-Mut+miRNA control 组4.2实验二分组:1.对照组（Control group）;2.缺氧/复氧组（H/R group）。4.3 实验三分组:1.miRNA control+H/R 组;2.miR-26a-5p mimic+H/R组;3.inhibitor control+H/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+H/R 组。5.qRT-PCR技术检测PTEN基因含量;Western Blot技术检测PTEN/PI3K/AKT蛋白表达量,方法类同第一章。结果1.Targetscan 预测 PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因。2.双萤光素酶报告实验显示与对照组相比,转染了野生型PTEN-3’UTR和miR-26a-5pmimics的萤光素酶活性显著降低（P=0.0003）;而共转染突变型PTEN-3’ UTR和miR-26a-5p mimics组与对照组相比萤光素酶活性无显著性差异（P>0.9999）。结果表明miR-26a-5p可直接与PTEN的3’ UTR作用。3.qRT-PCR检测H/R心肌细胞中PTEN基因含量,结果显示H/R组PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0038）。Western Blot检测H/R心肌细胞中PTEN蛋白表达含量,结果显示H/R组PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P=0.0001）。4.通过心肌细胞转染,分别构建过表达miR-26a-5p组、敲低miR-26a-5p组以及相应对照组,Western Blot检测显示过表达miR-26a-5p显著下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显著提高了 PI3K和AKT的表达水平;相反的,敲低miR-26a-5p显著上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显著降低了 PI3K和AKT的表达水平（P<0.001）。结论及意义1.在心肌缺血再灌注过程中,PTEN是miR-26a-5p的靶基因。2.过表达miR-26a-5p可以通过与PTEN的3’UTR结合而负性调控PTEN蛋白表达,PTEN受抑制后反向激活PI3K/AKT通路,达到抗心肌细胞凋亡目的,从而改善心肌缺血再灌注损伤。3.通过研究miR-26a-5p具体调控机制有助于我们更深入的理解缺血再灌注损伤的机制,有助于开发心肌缺血再灌注损伤新的药物或非药物治疗手段。第三章miR-26a-5p在缺血再灌注小鼠心肌组织中的表达及其调控机制目的在之前的研究中,我们通过体外实验建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,发现H/R组心肌细胞凋亡率增高,miR-26a-5p在H/R组心肌细胞中表达下降,过表达miR-26a-5p减轻了心肌细胞缺血再灌注损伤。同时发现PTEN是miR-26a-5p的靶基因,miR-26a-5p通过PTEN/PI3K/AKT通路改善心肌缺血再灌注损伤。在这一章中,在小鼠体内心脏实验中,我们进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤是否会有相同的影响。方法1.缺血再灌注损伤小鼠模型的建立:C57BL/6小鼠麻醉后取仰卧位,气管插管后连接动物呼吸机,小鼠四肢通过电极连接到心电图仪。碘伏消毒胸前区后,第三和第四肋间行开胸手术。在左冠状动脉前降支距离左心耳下缘1-2mm处对冠状动脉左前降支进行结扎,发现明显的ST段抬高时表示结扎成功,阻断血流后30分钟,缝合线被释放,冠状动脉重新恢复血流,小鼠心肌缺血再灌注模型建立成功。在假手术组中,缝线只穿过小鼠的心脏,不进行结扎。2.小鼠心肌转染:构建腺相关病毒AAV9-miRNA载体,8周龄C57BL/6小鼠随机分组后,通过尾静脉注射AAV9-miRNA-26a-5p或AAV9-control构建转染模型。3.动物实验分组3.1实验一分组:1.假手术组（Shamgroup）;2.缺血再灌注损伤组（I/R group）。3.2 实验二分组:1.miRNA control+I/R 组;2.miR-26a-5pmimic+I/R组;3.inhibitor control+I/R 组;4.miR-26a-5p inhibitor+I/R 组。4.TTC-Evans blue双染法检测各组小鼠心肌梗死面积。5.流式细胞学技术测定动物实验中各组小鼠心肌细胞凋亡率。6.实时萤光定量PCR检测各组小鼠心肌组织中miR-26a-5p、PTEN含量。7.Western Blot 实验检测 cleaved caspase-3、PTEN、PI3K、AKT 的表达。结果1.Evans blue/TTC染色观察I/R组小鼠的心肌梗死面积大于对照组（P=0.0058）。流式细胞学技术显示I/R组小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡率明显高于对照组,I/R组小鼠心肌细胞的凋亡率是40.24%,对照组心肌细胞凋亡率为8.83%,差异明显。Wesetern Blot检测显示I/R组小鼠心肌cleaved caspase-3蛋白含量明显高于对照组（P=0.0015）。2.qRT-PCR方法检测结果显示I/R组小鼠心肌细胞中miR-26a-5p的表达量显著低于正常对照组（P<0.0001）。3.qRT-PCR的方法检测各组转染小鼠心肌中miR-26a-5p的表达,结果显示转染miR-26a-5p mimic小鼠心肌中miR-26a-5p的水平明显升高;而转染miR-26a-5p inhibitor 小鼠心肌中 miR-26a-5p 含量明显降低（P<0.01）。Evans blue/TTC染色观察发现过表达miR-26a-5p显著减少了小鼠心肌I/R后梗死面积,受抑制miR-26a-5p组小鼠心肌I/R后梗死面积显著大于对照组（P<0.05）。4.qRT-PCR检测发现I/R组小鼠心肌PTEN基因含量明显高于正常对照组（P=0.0080）。Western Blot检测结果显示I/R组心肌组织中PTEN蛋白表达含量明显高于对照组（P<0.0001）。5.Western Blot检测显示在小鼠I/R损伤模型中,与对照组相比,过表达miR-26a-5p显著下调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显著提高了 PI3K和AKT的蛋白表达水平;相反的,抑制miR-26a-5p组显著上调了 PTEN的蛋白表达水平,同时显著降低了 PI3K和AKT的蛋白表达水平,组间差异具有统计学意义（P<0.001）。结论及意义1.与正常对照相比,缺血再灌注小鼠模型中,心肌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达量升高,缺血再灌注组织中miR-26a-5p的表达明显下降;miR-26a-5p的过表达减轻了心肌缺血再灌注损伤;而miR-26a-5p低表达可以增加心肌凋亡来加重心肌缺血再灌注损伤。2.体内实验进一步验证了缺血再灌注组织中PTEN基因及蛋白表达量明显升高,PTEN 是 miR-26a-5p 的靶基因;miR-26a-5p 可以通过 PTEN/PI3K/AKT 通路调控心肌缺血再灌注损伤。3.我们体内实验的研究结果进一步验证miR-26a-5p对心肌缺血再灌注损伤的调控作用和机制,为开发心肌缺血再灌注损伤新的早期诊断生物标志物或新的治疗手段提供实验基础。