论文部分内容阅读
研究背景与目的结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是一类常见的消化系统恶性肿瘤,具有发病率高、预后差的特点。目前影响其治疗效果与导致CRC患者死亡的最主要原因是转移性结直肠癌。大部分转移性结直肠癌患者面临着无法治愈以及很难从CRC治疗中获益等困难与挑战。因此,探索结直肠癌转移的机制网络也许能对结直肠癌早期干预及治疗提供重要的思路与线索。近年来,关于结直肠癌发生发展机制网络的研究开始集中在转录后调控的方式。DDX39B是一类调控RNA代谢几乎所有过程的RNA解旋酶,它的功能学研究十分丰富,涵盖剪接体和mRNA核输出复合物等,但其在疾病学特别是肿瘤中的作用及潜在的分子机制尚不明确。而DDX39B主要负责对基因转录后产物进行剪接、核输出的修饰,由负责转录后修饰的DDX39B本身表达或功能异常即可能会影响相应下游基因（促癌/抑癌因子）的表达,进而影响疾病的进展。本课题拟首先利用生物信息学分析、结合分子生物学实验检测DDX39B在结直肠癌中的表达情况,并通过一系列细胞侵袭转移相关的功能学实验,探索DDX39B在结直肠癌侵袭转移中的作用。其次借助转录组学测序为寻找DDX39B的下游靶点提供思路与线索,并最终利用生物学实验验证和深入讨论DDX39B在结直肠癌进展中涉及的转录后调控机制及潜在分子间互作关系,也许能对结直肠癌诊断、治疗与预后这三个方面提供部分理论依据与潜在的分子靶点。资料与方法1.DDX39B在结直肠癌组织及细胞中的表达1)通过生物信息学（TCGA和GEO数据库）分析CRC组织中DDX39B的表达情况及其与CRC患者预后的相关性;2)通过qRT-PCR、Western blotting,IHC实验以检测在配对CRC组织中DDX39B的mRNA与蛋白的表达量以及在常用几种CRC细胞中DDX39B的蛋白表达量。2.DDX39B对结直肠癌细胞侵袭及转移能力的影响1)构建DDX39B稳定过表达株与瞬转干扰株,经Western blotting和qRT-PCR实验验证效率后,通过Transwell小室迁移和侵袭实验、细胞划痕愈合实验探索过表达与敲低DDX39B后细胞的迁移及侵袭能力变化;2)选取干扰片段进行DDX39B稳定干扰株构建,并通过裸鼠回盲部原位瘤种植转移模型探索干扰DDX39B后细胞的转移能力变化。3.DDX39B 在结直肠癌上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）中的作用1)进行Western blotting和qRT-PCR实验,以探索过表达及干扰处理DDX39B后EMT相关分子的mRNA和蛋白表达情况;2)通过免疫荧光细胞骨架染色探索过表达及干扰处理DDX39B后细胞间紧密连接作用及形态变化;3)通过使用裸鼠回盲部原位瘤组织切片,对EMT关键蛋白进行免疫组化及荧光染色,观察其表达变化。4.DDX39B在结直肠癌中调控下游靶基因的分子机制1)通过高通量测序RNA-seq和RIP-seq为DDX39B在结直肠癌中可能调控的下游靶基因提供思路;2)通过qRT-PCR验证RNA-seq结果,选取随着DDX39B表达变化而出现表达明显差异变化的分子FUT3,并通过连续组织切片染色以及qRT-PCR实验探索DDX39B与FUT3的表达相关性;3)结合RIP-seq结果,构建FUT3的Minigene进行体外剪接实验验证DDX39B调控FUT3的剪接,并通过RNA核浆分离实验验证DDX39B参与FUT3成熟mRNA的核输出。5.DDX39B-FUT3-TGFβR-I调控结直肠癌侵袭转移和EMT1)通过蛋白核浆分离实验检测过表达或敲低DDX39B后,TGFβ/SMADs信号通路下游相关分子的表达变化;2)橙黄网胞盘菌凝集素可特异性识别a（1,3）岩藻糖苷键,通过凝集素实验检测过表达或敲低DDX39B后,总TGFβR-I和岩藻糖基化的TGFβR-I表达情况,并通过免疫荧光验证TGFβR-I和该凝集素的表达情况;3)通过对DDX39B过表达株使用TGFβR-I抑制剂SB431542,探索TGFβR-I抑制剂是否影响DDX39B激活TGFβ/SMADs信号通路和促进结直肠癌细胞侵袭转移的能力;4)通过对DDX39B干扰株使用TGFβ1刺激诱导,探索敲低DDX39B组与对照组对TGFβ1刺激的应答情况;5)通过对DDX39B过表达株行FUT3敲低,验证敲低FUT3后是否影响DDX39B激活TGFβ/SMADs信号通路和促进结直肠癌细胞侵袭转移的能力。统计学分析使用Excel 2016与Graph-Pad Prism software进行统计学分析。其中,通过使用配对样本t检验或非参数检验ANOVA以统计分析样本间的差异对比。相关性分析采用Spearman相关性分析。P<0.05被认为有统计学意义。研究结果1.生物信息学分析结果显示DDX39B在结直肠癌组织（配对、非配对）中的表达水平均较癌旁正常组织高,且在不同的病理类型和分期中,DDX39B的表达均上调。生存分析（GSE17536,GSE17538）结果提示高表达DDX39B的结直肠癌患者预后明显不良;2.本研究中心数据表明,对于组织、mRNA及蛋白水平,DDX39B在结直肠癌中的表达水平均高于癌旁正常组织;3.Transwell小室迁移及侵袭实验、细胞划痕愈合实验及裸鼠盲肠原位瘤种植转移模型均验证DDX39B可增强结直肠癌细胞的侵袭、转移能力;4.EMT相关分子蛋白质和mRNA表达、细胞骨架染色以及组织切片免疫荧光染色结果均提示DDX39B可促进结直肠癌细胞的EMT;5.RNA-seq和RIP-seq结果提示DDX39B可通过直接结合于FUT3的pre-mRNA从而上调FUT3的表达水平;6.连续切片（结直肠癌配对组织）的免疫组化及荧光染色、mRNA表达相关性实验结果证实DDX39B的表达与FUT3的表达呈强相关;7.Minigene体外剪接实验及RNA核浆分离实验证实DDX39B可通过促进FUT3 pre-mRNA剪接和成熟FUT3 mRNA核输出作用从而上调FUT3表达;8.蛋白核浆分离实验结果提示DDX39B促进TGFβ/SMADs信号通路激活;9.凝集素实验验证DDX39B通过FUT3促进TGFβR-I的岩藻糖基化;10.回补实验（TGFβR-I抑制剂、TGFβ1刺激、FUT3敲低）验证DDX39B-FUT3-TGFβR-I的级联反应促进了结直肠癌EMT及侵袭、转移。研究结论DDX39B在结直肠癌中的表达上调,DDX39B上调后可促进结直肠癌细胞EMT及侵袭、转移,其涉及的机制可能是通过DDX39B-FUT3-TGFβR-I以实现。