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苦丁茶(Ilex kudingcha C.J.Tseng),多年来一直在中国作为凉茶食用,并且能治疗各种疾病,包括脱水,中暑,鼻炎,结膜充血和头痛等。苦丁茶含有多种生物活性化合物,经试验研究发现其具有显著的抗癌,抗炎,抗糖尿病和降血脂等作用。绿原酸作为苦丁茶中的抗炎成分,目前研究较多的是其抗肿瘤和抗氧化等活性,关于绿原酸抗炎作用也只停留在表象,对其作用的机理研究非常有限。本实验旨在研究苦丁茶提取物中绿原酸的抗炎作用机制,为绿原酸用作抗炎药物提供理论基础,更为苦丁茶应用于医药产业提供参考。本试验以苦丁茶冬青老叶、绿原酸和转基因斑马鱼(mpx:斑马鱼及小鼠为试验材料,具体步骤如下:1.用灭菌后的手术刀片对斑马鱼幼鱼距离尾尖0.4mm处切断建立炎症模型,利用胚胎数量实现高通量筛选,通过在培养液中加药的方法,评估苦丁茶提取物及绿原酸对斑马鱼胚胎炎症部位中性粒细胞募集的影响。2.通过Tunel原位末端凋亡标记法检测加药后的斑马鱼胚胎炎症部位细胞的凋亡情况;进一步确认药物对激活细胞增殖和凋亡相关蛋白ERK1/2、AKT1/2/3、AMPK三种蛋白质的表达,并用相关蛋白抑制剂处理斑马鱼胚胎进一步确认这些蛋白在中性粒细胞募集过程中的作用。3.利用共聚焦显微镜观察药物处理后中性粒细胞在炎症过程中的迁移的变化。再用RT-qPCR确认中性粒细胞迁移相关基因在不同时间的表达量。主要研究结果如下:1.苦丁茶老叶用甲醇超声浸泡的提取物中绿原酸含量为1.32%;2.转基因斑马鱼(mpx:EGFP)斑马鱼胚胎在受精后72h进行苦丁茶提取物和绿原酸处理,结果显示,在苦丁茶提取物处理胚胎24h,在400和600μg/mL对尾部中性粒细胞的募集数量有显著下降的效果,但及对全身中性粒细胞的数量无明显影响;绿原酸在处理24h,在80和120μg/mL对尾部中性粒细胞的募集有显著抑制效果,对全身中性粒细胞的数量也无明显影响;绿原酸处理3h后,斑马鱼全身和尾部受伤部位中性粒细胞无任何显著影响;3.绿原酸能够抑制细胞增殖相关蛋白ERK1/2、AKT的磷酸化,进而促进了凋亡蛋白的表达,提高细胞凋亡水平,以促进炎症部位中性粒细胞快速解决,而苦丁茶提取物,而;为了进一步验证绿原酸可以通过这些蛋白对炎症部位的中性粒细胞产生影响,我们用这些蛋白质的磷酸化抑制剂以及促凋亡相关蛋白caspase抑制剂Z-VAD-fmk与绿原酸联合处理斑马鱼胚胎,结果显示,当促增殖相关蛋白被抑制后炎症部位中性粒细胞的聚集集进一步减少,而caspase凋亡蛋白的抑制剂能有效缓解绿原酸引起的中性粒细胞减少。Tunel染色法结果表明,绿原酸处理后尾部炎症部位中性粒细胞的凋亡水平显著增加。对小鼠外周血分离出的中性粒细胞经CGA处理后我们发现,CGA对中性粒细胞的凋亡有显著促进作用;4.共聚焦细胞追踪结果显示,绿原酸处理10h尾部炎症部位中性粒细胞的反向迁移更为显著;RT-qPCR结果表明,绿原酸对炎症前期中性粒细胞正向迁移的相关基因没有影响,但能显著提高炎症后期中性粒细胞从炎症部位的反向迁移能力。综上所述,苦丁茶能有效抑制中性粒细胞的募集减缓炎症反应。绿原酸加快了炎症部位聚集的中性粒细胞的减少这一过程中,ERK1/2、AKT1/2/3的磷酸化和caspase的表达存在着某种关联共同作用于中性粒细胞促进其凋亡以减少其在炎症部位的聚集;除此之外,绿原酸还能促进中性粒细胞在炎症后期反向迁移能力;总而言之,绿原酸能从凋亡和细胞迁移能力两个方面影响中性粒细胞的炎症效应。