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1.背景与目的:内皮功能紊乱是血管性疾病的重要的病理生理基础,再血管化内皮和再内皮化是介入治疗和药物支架后阻止再狭窄和血栓形成的重要环节。大量的证据表明,骨髓源内皮前体细胞(endothelial precusor cells, EPCs)在血管内皮修复和内皮功能替代上起了重要的作用。更进一步研究表明,EPCs的增殖与分化是影响内皮修复的重要环节, EPCs在体内能够分化成有功能的内皮细胞,参与缺血组织的血管新生并整合到损伤血管壁的新生内膜中参与损伤血管的再内皮化。但是,EPCs的归巢、增殖、分化,其受多种因素影响,其内在调控因素尚不完全清楚。转录因子KLF4通过对其下游基因的调控,在细胞增殖、分化、血管生成和肿瘤发生发展等多种生理、病理过程中起着重要作用。近几年,研究表明KLF4调控多种细胞的增殖分化,可能是调节血管功能和疾病的重要“分子开关”。KLF4最早发现于内脏和上皮,具有促进细胞终端分化、成长、循环的功能。其为血流及炎症因子激活,KLF4高表达能够上调eNOS、TM,具有抗炎、抗血栓作用。在本研究我们主要通过构建携带KLF4基因的腺病毒载体,过表达KLF4或小RNA干扰转染实验,阐明KLF4在EPCs分化及修复损伤血管中的作用及其机制,期望为深入认识KLF4的生物学功能及EPCs的调控机制提供新的实验依据,为进一步促进血管损伤后内皮再生、血管良性修复提供新的策略和靶点。2.方法:2.1 KLF4在EPCs分化中的表达通过密度梯度离心及选择性培养的方法在体外分离、培养大鼠骨髓源EPCs,经过细胞形态学、表面分子标志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I双阳性鉴定后,通过RT-PCR以及Western blot分别观察KLF4在EPCs分化过程中mRNA和蛋白表达水平的表达。2.2重组腺病毒Ad-KLF4的构建从大鼠组织提取RNA,经RT-PCR扩增得到目的基因KLF4片段,首先构建重组穿梭质粒pTOPO-KLF4。将pTOPO-KLF4与腺病毒载pAd在重组酶的作用下,pTOPO-KLF4的attL1-attL2序列与腺病毒载体的attR1-attR2序列发生同源重组。重组子命名为pAd-KLF4。pAd-KLF4和空载体pAd经PacI酶切线性化,暴露出载体的反向终末重复序列,将重组子转染293细胞进行包装,扩增后进行滴度的测定。2.3 KLF4在EPCs分化中的作用在EPCs通过Ad-KLF4过表达或siRNA沉默KLF4观察EPCs分化的表型改变,通过免疫荧光、流式细胞学、RT-PCR以及Western blot分别观察成熟血管内皮表型CD31、VWF在EPCs分化过程中免疫荧光、mRNA和蛋白水平的表达。2.4 KLF4在EPCs分化中的分子机制在EPCs通过Ad-KLF4过表达或siRNA沉默KLF4对下游靶基因eNOS的在转录、蛋白表达水平的影响,进一步观察了eNOS抑制剂L-NAME,对Ad-KLF4诱导的EPCs分化的影响,以明确eNOS是否参与Ad-KLF4介导调控的EPCs分化。2.5 Ad-KLF4转染的EPCs与平滑肌细胞共培养对平滑肌的增殖及迁移的影响培养大鼠血管平滑肌细胞和内皮细胞,将Ad-KLF4转染的EPCs接种于下室,分别将平滑肌细胞接种于上室,建立细胞共培养体系,通过3~H-TdR参入法检测平滑肌细胞的增殖作用,用迁移计数方法检测平滑肌细胞。2.6转染KLF4基因的EPCs移植在血管内膜修复中的作用建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,将Ad-KLF4转染的EPCs通过尾静脉移植至大鼠体内。2周后在局部血管,通过荧光定量RT-PCR以及Western blot分别观察KLF4在血管损伤修复过程中mRNA和蛋白表达,行HE染色、伊文氏蓝染色计算内膜/中膜面积比及损伤血管再内皮化情况。3.结果:3.1 KLF4在EPCs分化中的表达3.1.1 EPCs鉴定分离培养的EPCs经过诱导分化后向内皮细胞表型转变,流式细胞检测及VEGFR-2和CD133在培养细胞中的阳性率分别为82.35%±2.04%,62.13±3.05%, Dil-acLDL/FITC- UEA-I双阳性细胞约占80%,说明所培养细胞是EPCs。3.1.2 EPCs向ECs分化的特征形态学变化:细胞在培养第3~4天可见部分贴壁细胞的多个细胞集落,呈圆形或不规则形,随之梭形细胞数量逐渐增加;第6~10天贴壁的梭形细胞从细胞团边缘出芽生长,呈放射状分布;14d后可观察到梭形细胞首尾相连形成条索状结构,梭形细胞基本接近融合,具有成索状或网状血管样生长趋势;21天细胞增多,融合后呈铺路石状。利用细胞流式分析技术(FACS)对EPCs的分子表面标记检测,发现在MNCs培养过程随时间的变化,在EPCs分化过程中,干细胞表型CD133逐渐减低,而成熟ECs表型逐渐增高。3.1.3 KLF4在EPCs分化中的表达在培养7天的MNCs细胞,免疫组化染色,阳性细胞成棕黄色,胞核为苏木精淡染,KLF4表达在EPCs的细胞核。在EPCs分化过程中,KLF4 mRNA在第4天较低,第7天表达逐渐增强,14天表达明显增强,分别为(0.41±0.025,0.1±0.008,0.720±0.017,1.223±0.013)各组间比较(P<0.01)。KLF4蛋白表达在第4天较低,第7天表达逐渐增强,14天表达明显增强(分别为0.41±0.025,0.1±0.008,0.72±0.017,1.22±0.013)各组间比较(P<0.01),14d时表达最强。3.2.重组腺病毒Ad-KLF4的构建从大鼠组织提取RNA,经RT-PCR扩增得到目的基因KLF4片段,首先构建重组穿梭质粒pTOPO-KLF4。将pTOPO-KLF4与腺病毒载pAd在重组酶的作用下,pTOPO-KLF4的attL1-attL2序列与腺病毒载体的attR1-attR2序列发生同源重组。重组子命名为pAd-KLF4。pAd-KLF4和空载体pAd经PacI酶切线性化,暴露出载体的反向终末重复序列,将重组子转染293细胞进行包装,扩增后进行滴度的测定,病毒滴度约为1.0×10~9 pfu/ml。3.3 KLF4在EPCs-ECs分化中的作用3.3.1 Ad-KLF4转染EPCsAd-KLF4转染后,检测EPCs中KLF4mRNA及蛋白表达发现Ad-KLF4明显高于转染Ad-GFP和未转染组以及对照组,Ad-GFP转染和未转染组之间无显著差异,表明Ad-KLF4的有效转染EPCs呈现高表达。3.3.2 Ad-KLF4转染EPCs对EPCs-ECs分化影响Ad-KLF4转染EPCs与Ad-GFP组相比,形态特征呈现出细胞贴壁伸展的更多,呈长梭形或多角形分化形态,向内皮形态变化。流式细胞学检测、免疫荧光、定量PCR及蛋白表达检测提示,Ad-KLF4转染与Ad-GFP转染组比较,Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1摄取阳性细胞计数增加,CD133、CD34mRNA显著降低,而成熟内皮表型vWF、CD31表型明显增高,表明转染Ad-KLF4促进了EPCs向成熟ECs表型的分化。3.3.3 KLF4-siRNA转染EPCs对EPCs-ECs分化影响经过KLF4siRNA内源性的干扰实验,发现在KLF4蛋白水平与阴性对照组比较,几乎不表达,表明进行了内源性的有效干扰,(0.98±0.03 vs 0.02±0.01 ,P<0.01, n=3)KLF4siRNA转染72小时后与阴性对照组相比,在EPCs分化过程中,成熟内皮表型CD31的蛋白表达与阴性对照组比较明显降低((1.43±0.04 vs 1.01±0.02 ,P<0.05,n=3),VWF的蛋白表达与阴性对照组比较也明显降低((1.21±0.06 vs 0.87±0.02 ,P<0.05,n=3)。3.4 KLF4在EPCs分化中的机制3.4.1 KLF4对eNOS表达的影响在转染Ad-KLF4后eNOS mRNA和蛋白表达比较Ad-GFP组明显升高,与未转染组比较也显著升高。在进行小RNA干扰阻断内源性的KLF4研究中发现,KLF4 siRNA转染eNOS mRNA及蛋白表达与阴性对照组比较,明显降低,与未转染组比较也表现降低。3.4.2 L-NAME对Ad-KLF4促进的EPCs分化表型的影响L-NAME加入Ad-KLF4转染72小时后检测蛋白表达分析,发现L-NAME干预组在EPCs分化为成熟内皮表型CD31、VWF的蛋白表达与Ad-KLF4降低,与未转染组相比也降低。培养液NO含量检测,发现Ad-KLF4组较和L-NAME干预组NO含量高,也明显高于对照组,L-NAME与Ad-GFP组比较无明显差异。体外血管生成,提示Ad-KLF4组较和L-NAME干预组数量多。3.5 Ad-KLF4转染EPCs与平滑肌共培养对平滑肌增殖和迁移的作用3.5.1 Ad-KLF4转染EPCs与平滑肌共培养对平滑肌增殖的作用Ad-KLF4转染的EPCs与Ad-GFP及为未转染组比较明显抑制血管平滑肌细胞3~H-TdR掺入,在Ad-KLF4及为未转染组之间血管平滑肌细胞3~H-TdR掺入无显著差异。应用siRNA阻断内源性的KLF4与阴性对照组比较平滑肌细胞增殖明显,3~H-TdR掺入与未转染组比较3~H-TdR掺入。在阴性对照组和未转染组之间比较无差异。3.5.2 Ad-KLF4转染EPCs与平滑肌共培养对平滑肌迁移的作用在进行平滑肌细胞迁移检测,结果表明,共培养6 h,Ad-KLF4转染的EPCs组明显抑制平滑肌细胞的迁移数,Ad-GFP与对照组比较比较差异无显著性。KLF4 siRNA转染EPCs组与阴性对照组比较平滑肌细胞迁移数明显增加。在阴性对照组和未转染组之间比较无差异。3.5.3 Ad-KLF4转染EPCs与平滑肌共培养对平滑肌P53蛋白的作用应用Ad-KLF4转染的EPCs与对照组比较平滑肌细胞的P53蛋白增加。Ad-GFP与对照组比较比较差异无显著性。KLF4 siRNA转染EPCs组与阴性对照组比较P53蛋白明显降低。在阴性对照组和未转染组之间比较无差异。3.6 Ad-GFP-EPCs移植在血管损伤修复中的作用3.6.1 Ad-GFP-EPCs移植对再内皮化的作用通过Evans blue染色发现, Ad-KLF4转染的EPCs移植组再内皮化率明显高于单纯,而Ad-GFP-EPCs移植组也高于球囊损伤组,各组之间比较,P<0.01,存在显著差异。3.6.2 Ad-GFP-EPCs移植对新生内膜的作用Ad-EPCs移植组在损伤2周后血管新生内膜、血管腔狭窄程度比较损伤未移植组和Ad-GFP组明显减轻,Ad-EPCs移植组新生内膜/中膜的比值较其他两组低。3.6.3 Ad-GFP-EPCs移植组局部损伤处KLF4的表达进行损伤血管的免疫组化检测。结果表明,正常血管KLF4表达极低,在Ad-KLF4转染的EPCs移植组,KLF4在新生内膜、中膜以及外膜组织均有表达,表达较强,而Ad-GFP-EPCs移植组表达降低,但较正常组明显增高,球囊损伤组KLF4表达比Ad-GFP-EPCs移植组减低,但均高于正常组。WesternBlot法进行损伤血管的KLF4蛋白检测。结果表明,正常血管KLF4蛋白表达极低,在Ad-KLF4转染的EPCs移植组,KLF4蛋白表达高于正常组、Ad-GFP-EPCs及球囊损伤组,其中KLF4表达球囊损伤组较Ad-GFP-EPCs移植组低,但均高于正常组,各组之间P<0.01。4.结论:4.1在EPCs分化过程中KLF4在分化晚期表达,逐渐增高。4.2过表达KLF4促进EPCs向成熟内皮分化。4.3过表达KLF4促进EPCs的eNOS表达,培养液的NO增多,eNOS抑制剂,L-NAME减低了KLF4在EPCs分化为成熟内皮表型CD31、VWF的蛋白表达,抑制了血管新生。4.4 KLF4基因修饰EPCs与平滑肌共培养明显抑制平滑肌的增殖和迁移,同时使平滑肌的P53蛋白表达增高。4.5 KLF4基因修饰EPCs移植抑制了损伤血管新生内膜,促进了再内皮化,在局部损伤处表达增高。