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第一部分PTEN基因在慢性淋巴细胞白血病中的表达及其临床意义目的：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)在细胞生长发育和凋亡方面起重要的调节作用。通过前期的预实验,我们发现PTEN基因在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中低表达,本研究旨在通过大样本标本研究PTEN基因在CLL中的表达情况及其临床意义。方法：收集103例初诊或6个月未治疗的CLL患者和20例健康正常人标本,荧光实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测两组PTEN mRNA表达水平。PCR联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常；流式细胞术(FCM)检测CLL细胞中CD38和ZAP-70表达水平。分析PTEN基因的表达以及与包括上述预后因素的关系。结果：PTEN基因在CLL患者和健康正常对照组的中位表达水平分别为0.0237(0～3.1167)和0.3302(0.0587～1.5911),差异具有统计学意义(P<0.001)。临床分期较早者(Binet A期)PTEN表达水平明显高于临床分期较晚者(Binet B期和C期)(P<0.001),血清乳酸脱氢酶(LDH)异常(>250U/L)或p2-微球蛋白(β2-MG)异常(>3mg/L)者PTEN表达水平要明显低于其水平正常者(P=0.019, P=0.036), ZAP-70阳性患者中PTEN表达水平明显低于ZAP-70阴性者(P=0.008),p53基因突变/缺失者PTEN表达水平要明显低于无突变／缺失者(P=0.005),细胞遗传学FISH预后不良／中等组PTEN表达水平要明显低于预后良好组(P=0.016)。多因素分析显示只有Binet分期(P=0.027)和p53突变/缺失(P=0.007)与PTEN的低表达相关。PTEN基因高转录水平组和低转录水平组的中位至首次治疗时间(TTFT)分别为49个月和未达到,具有显著性差异(P=0.040),但Cox多因素生存分析只有Binet分期是TTFT的独立预后因素(P<0.001)。结论：PTEN基因在CLL患者中低表达,低转录水平的PTEN与CLL的不良预后因素相关,PTEN基因可能在CLL的预后中起重要作用。第二部分PTEN基因单核苷酸多态性与慢性淋巴细胞白血病细胞PTEN低表达相关性研究目的：前期实验我们发现人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)基因在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中低表达,PTEN基因在人类许多肿瘤细胞中因突变或缺失影响其基因表达和功能。为探索PTEN基因低表达的具体机制,本研究旨在探讨CLL患者中PTEN突变是否存在从而影响其表达。方法：收集154例初诊或6个月未治疗的CLL患者和200例配对的健康正常人标本,采用聚合酶链式反应(PCR)联合DNA测序的方法检测了PTEN基因第5-9外显子的基因序列。PCR联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常；流式细胞术(FCM)检测CLL细胞中CD38和ZAP-70表达水平。分析PTEN基因突变与包括上述预后指标等的关系。结果：154例CLL患者和200例正常对照人群标本均未发现PTEN基因第5-9外显子的突变,CLL患者和正常人群在第8内含子intron8c.1026+32存在一处单核苷酸多态性(SNP)位点,位点编号为rs555895。CLL患者该位点的T/T、T/G和G/G基因型频率分别为24.0%、52.6%和23.4%,与正常对照人群对应的17.0%、58.5%和24.5%的基因型相比,并未有统计学意义(P=0.255)。CLL患者的T/T纯合子基因型与(T/G+G/G)基因型频率分别为24.0%和76.0%,与正常对照人群相比,在统计学上也未出现显著性差异(P=0.102),此位点的T/T纯合子基因型与(T/G+G/G)基因型频率与CLL患者的一般生物学特征也未表现显著差异。结论：PTEN基因突变在CLL细胞中罕见,我国汉族CLL患者PTEN基因的低表达可能与此基因的突变无关。第三部分PTEN基因启动子甲基化状态与慢性淋巴细胞白血病PTEN低表达相关性研究目的：表观遗传学在不改变DNA序列的前提下调节基因的表达。慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)的低表达可能受表观遗传学的影响,如DNA启动子的甲基化或微小RNA(microRNA, miRNA)的干扰等。本部分实验旨在研究PTEN基因启动子的甲基化和CLL细胞中PTEN基因的低表达的相关研究,探讨CLL细胞中PTEN基因低表达的机制。方法：收集75例CLL患者和25例配对的健康正常人标本,用常规方法从外周血或分离的淋巴细胞中抽提基因组DNA。采用巢式甲基化特异性聚合酶链式反应(nMSP)检测PTEN基因启动子序列是否发生甲基化,同时设立EpiScope(?)Methylated HeLa gDNA作为阳性对照品,阳性结果均使用基因测序法验证。聚合酶链式反应(PCR)联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常；流式细胞术(FCM)检测CLL细胞中CD38和ZAP-70表达水平。分析PTEN基因的甲基化状态与CLL预后指标的关系。结果：75例CLL患者仅发现一例存在PTEN基因的部分甲基化(1.33%),正常对照标本均未出现甲基化,而阳性对照出现明显的甲基化条带。甲基化状态经测序后验证,测序图中显示甲基化患者的C序列未发生改变,而无甲基化者碱基C变成T。分析此例部分甲基化的患者的临床特征,表现为ZAP-70阳性和共济失调性毛细血管扩张突变(ATM)基因缺失。结论：PTEN基因启动子甲基化在CLL细胞中少见,CLL中PTEN基因的低表达可能与该基因的甲基化状态无关。第四部分微小RNA与慢性淋巴细胞白血病细胞PTEN低表达的相关研究目的：微小RNA(microRNA, miRNA)作为表观遗传学的表现形式之一,对调控基因表达发挥重要作用。成熟miRNA通过与目标基因的mRNA结合,形成RNA诱导的基因沉默复合体,发挥类似抑癌基因或癌基因的功能。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)作为一种抑癌基因,在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中低表达,有可能受到miRNA的靶向沉默作用。本实验为研究PTEN和miRNA表达调控之间的关系。方法：通过生物信息学方法候选出调控PTEN基因的保守miRNA,构建双荧光素酶报告基因载体,分别构建含有靶基因PTEN3’非翻译区(UTR)的pEZX质粒,采用脂质体2000与侯选的50nM、100nM、200nM和400nM四个梯度的miRNA类似物或阴性对照(NC)共转染人源胚胎肾细胞293T细胞株,24h后观察荧光素酶的活性；转染验证后的反义miRNA于CLL原代细胞,培养24hCLL原代细胞后,采用蛋白免疫印迹杂交(WB)和聚合酶链式反应(PCR)技术检测转染PTEN基因和miRNA的前后变化,流式细胞术(FCM) Annexin/PI双染法检测转染前后的细胞凋亡率。PCR联合DNA序列测定p53突变和免疫球蛋白重链可变区(IGHV)突变；间期荧光原位杂交(FISH)技术检测细胞遗传学异常；FCM检测CLL细胞中CD38和ZAP-70表达状况。结果：检索miRNA数据库侯选出6个相对保守可能调节PTEN基因的miRNA: hsa-miR-19a、hsa-miR-21、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-214和hsa-miR-1297。双荧光素酶报告实验显示hsa-miR-21minic、hsa-miR-26a minic和hsa-miR-214minic均对PTEN基因有显著抑制作用。反转录PCR方法检测转染反义hsa-miR-21、反义hsa-miR-26a和反义hsa-miR-214的miRNA水平,与阴性NC相比,相应的miRNA明显受抑制(P=0.014、P=0.040和P=0.001)。FCM检测到转染反义hsa-miR-26a和反义hsa-miR-214组的细胞凋亡率要明显高于转染NC组(P<0.001和P=0.001),通过WB和PCR证实转染反义hsa-miR-26a和反义hsa-miR-214组的PTEN的蛋白和mRNA水平均较NC组上调。结论：CLL细胞中PTEN基因的低表达可能与hsa-miR-26a和hsa-miR-214的异常表达相关,抑制hsa-miR-26a和hsa-miR-214表达可通过增加PTEN基因的活性而促进CLL细胞凋亡,此为CLL患者的靶向治疗提供理论依据。