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乙偶姻(3-羟基-2-丁酮),是一类具有奶香气味的α-羟基酮,用途广泛,具有很高的市场价值,特别是手性(R)-乙偶姻在制药与化学合成领域具有重要应用。而体外酶法在生产手性高附加值产品中具有高得率高产率,耐受性高,反应调控调控简单等诸多优点,在生产手性(R)-乙偶姻具有极大潜力。本课题中体外合成(R)-乙偶姻所选地合成途径为丙酮酸途径,该途径由两步反应组成,分别由乙酰乳酸合成酶(ALS)和乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)催化。课题选择了Bacillus subtilis168,Enterobacter cloacae ATCC 13047和Streptococcus thermophiles CNRZ1066来源的ALS以及B.subtilis 168,Lactococcus lactis NCDO 2118和S.thermophiles CNRZ1066来源的ALDC,并测定了每个酶的最适p H、最适温度、比酶活和稳定性相关酶学性质参数,最终选择比酶活和稳定性均更好的B.subtilis 168来源的ALS(bsu-ALS)和ALDC(bsuALDC)以丙酮酸为底物体外生产(R)-乙偶姻。然后,以200 m M丙酮酸钠为底物,利用bsu-ALS和bsu-ALDC双酶体系生产乙偶姻,并对缓冲体系,反应体系初始p H,反应温度,反应转速以及酶比例等条件进行优化。最终在p H 7.0的磷酸缓冲溶液中,分别加入0.24 U/m L的bsu-ALS和0.06 U/m L的bsu-ALDC(酶比例为4:1),45℃静置反应时,200 m M丙酮酸可以在4 h可转化为8.80 g/L(99.9 m M)乙偶姻,转化率为99.9%,得率为0.499 mol/mol(达到理论得率的99.9%)。最后为继续提高乙偶姻产量,课题进行了底物浓度放大实验,并通过提高bsu-ALDC酶量及降低反应温度对3 M丙酮酸反应浓度下进行进一步条件优化,成功提高了高浓度底物条件下乙偶姻的产量与得率,最终在30℃静置反应,各加入3.6 U/m L的bsu-ALS和bsu-ALDC时,可在12 h内将3 M丙酮酸钠转化为127.6 g/L(1.45 M)的乙偶姻,最高手性纯度高达99.9%,是目前体外酶法生产(R)-乙偶姻的最高产量,得率为0.483 mol/mol,产率可达10.63 g/L/h。本课题成功在体外重新构建了丙酮酸途径,并筛选出了能高效转化丙酮酸生产(R)-乙偶姻的bsu-ALS和bsu-ALDC组合,通过对反应中重要因素的优化,实现了低成本底物丙酮酸盐到高附加值产品(R)-乙偶姻的高效生产。