论文部分内容阅读
研究背景多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种以中枢神经系统（central nervoussystem, CNS）白质炎性脱髓鞘为病变特征的自身免疫性疾病，确切病因和发病机制尚不明确。传统的免疫学观点认为细胞免疫在该病的发生中具有关键作用，但近年来B细胞介导的体液免疫逐渐成为MS研究的热点，来自动物实验、尸检研究、外周血和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）细胞分析、以及临床B细胞去除治疗的诸多证据均支持了B细胞免疫及抗体在MS发病中的重要作用，但在MS中B细胞是如何活化及其调控机制尚不完全清楚。新近研究表明，滤泡辅助性T细胞（T follicularhelper cells, Tfh）是一群表型为CD4+CXCR5+的T细胞亚群，可辅助B细胞活化、增殖、分化并形成生发中心（germinal center, GC）。Tfh细胞作为B细胞活化的真正辅助者，其发现被认为是T-B细胞协作研究的重大突破[1]，疾病状态下Tfh细胞的功能变化已成为当前相关研究的热点之一。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis, EAE）作为MS的经典动物模型，Tfh细胞及与B细胞相互作用对该自身免疫性疾病的影响如何同样有待深入探讨。目的建立并评估EAE小鼠模型；观察EAE小鼠脾脏生发中心以及脊髓异位淋巴滤泡样结构的形成；探讨Tfh细胞、B细胞及其细胞亚群在不同病程时期EAE小鼠外周免疫器官和病变靶器官中的比率变化，以期提供Tfh细胞参与EAE疾病过程的初步证据。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55（myelin oligodendroglia glycol protein,MOG35-55）多肽诱导C57BL/6小鼠，建立EAE动物模型；用苏木素-伊红（hematoxylinand eosin, HE）染色和劳克坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）染色评估EAE发病小鼠脊髓组织中的病理学改变；利用多重免疫荧光染色方法观察EAE小鼠脾脏中生发中心的形成以及免疫细胞的位置变化，在脊髓组织中寻找异位淋巴滤泡样结构；借助流式细胞检测方法观察不同病程时期EAE小鼠脾脏、淋巴结及脊髓中Tfh细胞与B细胞及其细胞亚群的比率变化，探讨其与EAE疾病变化的关系。结果MOG35-55多肽免疫小鼠最早于免疫后第11天开始起病，发病主要集中在免疫后第12-16天，于发病后4.25±0.74天达到疾病高峰，总体发病率在90%左右。患病小鼠主要表现为不同程度的肢体瘫痪，并以双后肢为主。HE染色显示在EAE小鼠脊髓组织切片中有大量炎症细胞浸润，主要分布在血管周围和脊膜处。LFB染色显示在EAE小鼠脊髓炎性病灶内可见多个髓鞘脱失区。多重免疫荧光染色发现EAE小鼠脾脏中生发中心形成并伴有T细胞、B细胞、滤泡树突状细胞（follicular dendriticcells, FDC）的位置变化；在EAE小鼠脊髓组织中发现了异位的淋巴滤泡样结构。与此同时，我们在EAE小鼠脾脏和脊髓组织中观察到了大量的CD4+CXCR5+ICOS+和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞。流式细胞术检测显示，在EAE发病前期、高峰期、缓解期以及慢性持续期小鼠脾脏、淋巴结和脊髓组织中Tfh细胞比率均显著增高，与正常对照组比较有统计学意义（P <0.05），其中尤以疾病高峰期的升高幅度最大。Tfh细胞亚型分析显示，在EAE小鼠病程中，Th1样Tfh细胞比率下降，而Th2样、Th17样Tfh细胞比率升高。与Tfh细胞变化趋势相似，在EAE病程的对应时间点，患病小鼠脾脏、淋巴结以及脊髓组织中的B细胞亚型均较正常对照组显著升高（P <0.05）。结论EAE导致了小鼠脾脏中生发中心的形成，同时伴随不同类型免疫细胞的位置迁移，并在EAE病变靶器官脊髓组织中形成了异位的淋巴滤泡样结构，且EAE不同病程时期小鼠外周免疫器官和病变靶器官中Tfh细胞及B细胞亚型比率始终处于较高水平，这些结果为Tfh细胞参与EAE疾病过程提供了初步的实验证据。