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提高作物氮利用效率对减少氮肥使用至关重要,在水稻中,硝酸盐转运蛋白、铵盐转运蛋白及氮同化相关的酶类对于提高氮利用效率起重要作用。亚洲栽培稻主要分为籼稻和粳稻两种亚型,已有研究表明,籼稻表现出比粳稻更高的氮利用效率。之前发现编码水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF6.5(OsNRT1.1B)具有籼稻和粳稻亚种分化特性,并且籼稻型OsNRT1.1B基因受到人工驯化选择,该基因部分解释了水稻籼粳亚种间氮利用差异存在的原因。那么在水稻漫长的进化过程中,籼粳稻亚种间还有哪些基因在氮利用效率差异中发挥作用值得进一步探索。 本研究中,我们利用美国农业部(USDA)在过去100多年从全世界不同国家收集的水稻微核心种质的重测序信息以及已发表公布的野生稻和栽培稻重测序信息,通过对编码氮吸收及转运(硝酸盐转运蛋白、铵盐转运蛋白)、同化利用(硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶等酶类)相关基因进行籼粳分化和进化选择分析,共得到6个基因存在籼粳稻亚种间分化并可能受到进化选择。OsNPF7.2基因是其中之一,表达分析表明,OsNPF7.2在根中具有较高表达,OsNPF7.2promoter∷GUS转基因植株染色及原位杂交实验分析表明,OsNPF7.2主要在根部中柱细胞中表达。OsNPF7.2在植物体内表达受到硝酸盐及高氮诱导。体外爪蟾细胞活性实验表明,OsNPF7.2在低氮和高氮条件下均可以转运硝酸盐。为了进一步鉴定OsNPF7.2的功能,我们通过TALEN及CRISPR-Cas9系统创制了OsNPF7.2基因突变体,osnpf7.2突变体在正常水培条件下与野生型相比表现出明显的生长弱势。通过对野生型和osnpf7.2突变体总氮含量的测定,发现osnpf72突变体根中氮浓度上升,而地上部分氮浓度下降。另外,通过15N吸收实验表明,OsNPFZ2的突变对植株根部硝酸盐吸收速率没有影响,但主要影响了硝酸盐从根部往地上部分转运。同时,OsNPF7.2发生突变时也导致钾离子浓度在根部上升,地上部分下降。 进一步在不同氮源水培条件下对野生型和osnpf72突变体的表型进行了观察,发现在铵-硝混合、纯硝酸盐和纯铵盐条件下,osnpf7.2突变体与野生型相比均表现出一定的生长弱势。而osnpf7.2突变体在铵盐和硝酸盐等比例混合条件下与野生型相比表现出的生长劣势大于纯硝条件。通过对多个氮利用相关基因包括编码硝酸盐转运蛋白、铵盐转运蛋白、硝酸还原酶的转录水平表达差异的检测,我们发现在铵-硝混合条件下的基因表达差异数量要大于纯硝酸盐培养条件,表明OsNPF7.2在不同氮源条件下对其它氮利用相关基因表达的影响不一致,这可能是导致不同氮源条件下osnpf7.2突变体与野生型生物量差异不同的原因。 由于OsNPF7.2具有籼粳分化的特点,利用籼粳稻染色体单片段代换系材料15N标记的硝酸盐吸收转运实验结果显示,籼稻型片段代换系比粳稻型受体亲本具有更强的硝酸盐转运能力。另外,OsNPF7.2的过表达植株在田间表现出比野生型具有更强的分蘖能力,导致单株产量增加。这些结果显示,OsNPF7.2对提高水稻氮利用效率具有潜在的应用价值。