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在维生素C两步发酵工艺中,第一步为醇糖转化,即在葡糖杆菌作用下D-山梨醇转化为L-山梨糖;第二步为糖酸转化,在普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare,俗称小菌)与其伴生菌(俗称大菌)组成的混合菌系的作用下L-山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸(KGA)。维生素C两步发酵实质上就是D-山梨醇和L-山梨糖的专一性生物氧化过程。阐明这一系列生物氧化过程的生化反应机制对于指导维生素C的遗传育种甚至通过代谢工程构建由山梨醇到KGA的一步发酵工程菌,都具有重要意义。本课题组已从小菌细胞裂解物中分离得到了催化山梨糖生物氧化的一种关键酶──山梨糖脱氢酶(SDH),该酶能够将L-山梨糖直接转化为KGA;同时构建了小菌的基因文库,并以SDH的抗体筛选文库,分离得到编码SDH的基因(sdh)。本文在上述工作基础上,首先在大肠杆菌中对山梨糖脱氢酶进行了高效表达,对表达产物进行了纯化,研究了该酶的最适反应温度、最适反应pH值、酶稳定性、米氏反应常数、酶的激活剂和抑制剂、金属离子的激活与抑制作用等重要性质。研究葡糖杆菌对山梨糖脱氢酶的影响。以氨甲酰化酶基因(hyuC)为报告基因,构建了山梨糖脱氢酶-氨甲酰化酶融合表达载体,在大肠杆菌中可以同时检测到山梨糖脱氢酶和氨甲酰化酶活性;而在葡糖杆菌中,只能检测到氨甲酰化酶活性,未检测到山梨糖脱氢酶活性。质粒稳定性实验和质粒回转实验说明该质粒在葡糖杆菌中稳定存在。由于hyuC基因位于sdh基因下游,融合基因的转录和翻译是从山梨糖脱氢酶到氨甲酰化酶,氨甲酰化酶在葡糖杆菌中表达说明包含山梨糖脱氢酶在内的融合蛋白能够在葡糖杆菌中转录并翻译,山梨糖脱氢酶可能被宿主的酶系降解失活。通过体外实验也证实葡糖杆菌裂解物对山梨糖脱氢酶具有降解作用。将山梨糖脱氢酶与葡糖杆菌裂解液保温过夜后,通过SDS-PAGE检测到电泳图谱上约60kD和49kD处出现两条明显条带,对这两条带进行蛋白质N-端序列分析,结果显示其N端的前3个氨基酸残基均为谷氨酰胺-苏氨酸-丙氨酸,推测49kD的蛋白条带是由60kD山梨糖脱氢酶蛋白C-端降解产生。对预测的sdh读框N-端蛋氨酸至谷氨酰胺之间23肽氨基酸序列分析,发现23个氨基酸中大部分氨基酸为疏水氨基酸,并与醇脱氢酶的信号肽序列有38%的同源性,推测山梨糖脱氢酶N-端的23肽可能是一段信号肽,与该酶在细胞膜上的定位相关。吡咯喹啉醌,又称吡咯并喹啉苯醌,英文名:pyrroloquinoline quinone,缩写为PQQ,另名为Methoxatin,化学名为,4,5-二氢-4,5-二氢化-1-氢吡咯(2,3f)醌-2,7,9-三羧酸,是一种新发现的多种氧化还原酶的辅基,不同于已知的辅酶或辅基(NAD、NADP、FMN、FAD、辅酶A、辅酶Q),目前被认为是一种新的B族维生素,具有一定的医药应用前景。PQQ的生理学功能主要表现在:刺激某些植物发育及微生物和人体细胞生长,作为动物体生长发育的必需因子,清除自由基保护机体免受自由基损害,防治肝损伤;促进神经生长因子合成等。在细菌中PQQ一般是由一组排列成簇的相关基因控制合成的,根据不同来源PQQ基因的同源性和对应关系可将PQQ基因归为7类,即pqqA、B、C、D、E、F、G。不同细菌合成PQQ所需基因数目不等。本文通过从土壤中筛选得到了两株PQQ高产菌株,产量达到60μg/ml。并对该两种菌株进行了16S-RNA鉴定。