论文部分内容阅读
双硫仑（disulfiram,DSF）是一种有近70年临床使用历史的酗酒治疗药物,其安全性已经得到广泛认证。双硫仑在进入血液后的代谢产物二乙基二硫代氨基甲酸（diethyldithiocarbamic acid,DDC）能快速与血液中的二价铜离子(Cu2+)形成二乙基二硫代氨基甲酸脂-铜螯合物（diethyldithiocarbamate–copper,DDC-Cu）,从而具有较强及特异地抑制肿瘤细胞的作用。本实验通过对不同非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞进行DDC-Cu处理,检测了细胞存活、细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬相关指标,发现DDC-Cu能明显抑制NSCLC细胞增殖,诱导细胞死亡,并导致细胞凋亡和细胞自噬相关分子指标改变。进而验证并确立了DDC-Cu螯合物在体外对NSCLC细胞的功能抑制作用及细胞研究模型。利用细胞培养基氨基酸稳定同位素标记技术（stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）鉴定DDC-Cu处理前后A549细胞的差异蛋白,通过重复和筛选鉴定到上调蛋白72个,下调蛋白43个。结合生物信息学与研究文献发现:核糖体生物发生因子NOP53（NOP53 ribosome biogenesis factor,NOP53）、核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2,RRM2）、Kunitz 2型丝氨酸肽酶抑制物（serine peptidase inhibitor kunitz type 2,SPINT2）、微染色体维持复合物2（minichromosome maintenance complex component 2,MCM2）的相关变化可能与肿瘤抑制功能相关。进一步实验发现,利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）干扰下调NOP53后,对NSCLC细胞的DDC-Cu敏感性几乎无影响,NOP53或为药物处理所导致的结果,并不影响参与相关功能调控;相反,当我们构建RRM2过表达细胞系后发现,RRM2过表达能降低DDC-Cu对细胞抑制能力;si RNA干扰下调RRM2后,发现能够抑制NSCLC细胞增殖、促进凋亡和自噬、阻滞细胞周期,以及增强细胞对于DDC-Cu药物敏感性。与此同时,由于RRM2蛋白下调发生在DDC-Cu药物处理细胞的早期,早于细胞凋亡分子标志物PAPR1剪切体的出现并且不受细胞自噬的调控,结合RRM2蛋白功能,提示RRM2可能参与了DDC-Cu对于NSCLC细胞的肿瘤抑制功能调控,或为关键因子之一。综上所述,通过建立和验证DDC-Cu药物处理NSCLC细胞模型,我们利用了蛋白质组学SILAC标记技术和生物信息学分析,发现和验证了DDC-Cu抑制肿瘤相关能力与RRM2蛋白相关,与RRM2相关的上下游调控蛋白和关键信号分子和功能信号通路有待进一步验证。