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氮素供应影响植物正常生长发育,开花,衰老,光合作用以及光合作用产物分配等过程。目前,我国在农业生产中氮肥使用量很高,但是氮肥利用率却很低,一方面造成肥料浪费,一方面造成水体富营养化等环境问题。研究植物氮素代谢及转运信号途径,提高肥料利用效率对农业生产非常重要。自噬是一种在所有真核生物进化中高度保守的细胞组分降解过程。当细胞遇到营养缺乏,衰老及其他环境胁迫时,自噬过程在调控细胞组分降解及氮素循环利用方面起重要作用。谷子(Setaria italica)起源于中国,同时具有抗旱及耐瘠薄特点,谷子已成为研究单子叶植物非生物胁迫耐受性的理想材料。目前,谷子全基因组测序已成功完成,但关于谷子非生物胁迫相关基因功能及作用机制的研究仍然很少。本研究在全基因组水平上筛选鉴定谷子自噬基因家族成员,并对该家族成员特性及表达谱进行分析。经过筛选,发现自噬相关基因SiATG8a在谷子低氮条件下表达量较高。本研究对SiATG8a的特性及功能进行进一步分析。同时,为了进一步研究SiATG8a的作用机制,筛选SiATG8a在拟南芥中的同源蛋白AtATG8a的互作蛋白,为阐明自噬作用调控植物低氮胁迫的响应机制创造条件。取得实验结果如下:1.通过谷子全基因组分析,谷子基因组中共鉴定出37个自噬相关基因。基因重复分析表明,片段重复和串联重复事件在谷子自噬相关基因ATG家族扩张过程中发挥重要作用。谷子与水稻共线性分析显示出两个物种中多数ATG基因定位在相似的共线区域内,说明自噬基因在两个物种中拥有共同的祖先。2.基因表达分析揭示共有31个谷子自噬相关基因表达受一个或多个植物激素诱导,26个基因受干旱,盐和冷诱导,24个基因受黑暗条件诱导表达,25个基因受氮饥饿诱导表达。qRT-PCR结果表明,在氮饥饿处理24 h后,37个自噬基因中SiATG8a表达量最高,说明该基因在谷子氮饥饿耐受性响应方面发挥重要作用。3.谷子自噬相关基因SiATG8a全长360 bp,编码119个氨基酸。亚细胞定位结果显示出SiATG8a定位在细胞膜和细胞质。SiATG8a基因在氮饥饿胁迫下表达升高,且随着处理时间增加表达量也随之升高,在第6天时表达水平达到最高值。4.在水稻中过表达SiATG8a,构建植物表达载体pMWB014:SiATG8a,利用农杆菌侵染方法获得转基因水稻,通过PCR及qRT-PCR分析表明,SiATG8a在转基因植株中可以稳定遗传并且正常表达。检测转基因水稻中18个自身自噬相关基因的表达,结果表明,SiATG8a基因的插入并没有影响水稻内源自噬相关基因的表达。基因功能分析结果显示,在氮饥饿处理条件下,SiATG8a转基因水稻长势,存活率,株高,鲜重以及根系表面积等均显著高于受体水稻;SiATG8a转基因水稻体内总蛋白含量明显减少,地上部分氮含量高于野生型。以上结果说明,SiATG8a基因表达可以明显提高转基因水稻在氮饥饿胁迫下的耐受性,促进自身体内氮素再循环作用加强。5.在拟南芥中过表达SiATG8a,构建植物表达载体pCAMBIA1302:SiATG8a,通过遗传转化方法获得转基因拟南芥。基因功能分析结果显示,氮饥饿条件下,与野生型拟南芥(WT)相比,SiATG8a转基因拟南芥对氮饥饿不敏感,且生长不受抑制。SiATG8a转基因植物侧根数,叶片总面积和根系总面积均高于野生型拟南芥。同时,SiATG8a转基因植株比野生型拟南芥总氮含量更高,总蛋白含量显著下降。以上结果表明,谷子自噬相关基因SiATG8a能显著提高转基因拟南芥对氮饥饿的耐受性。这一结果与转基因水稻功能验证结果一致,说明SiATG8a在单子叶及双子叶植物中都可以显著提高植物对低氮胁迫的耐性,具有重要的利用价值。6.以SiATG8a拟南芥同源蛋白At ATG8a为诱饵,利用泛素分离系统筛选互作蛋白,通过鉴定发现G蛋白α亚基,AtGPA1可以与AtATG8a互作。通过双分子荧光互补试验(BiFC)证明,AtGPA1与AtATG8a在细胞膜上互作。植物细胞内含物的含量可以间接反应植物自噬过程强弱。通过透射电镜观察拟南芥叶片内含物含量,初步推测AtGPA1突变后影响植物自噬过程。总之,通过对谷子基因组自噬相关基因进行系统分析筛选获得SiATG8a基因,基因功能分析显示,SiATG8a可以显著提高水稻及拟南芥对低氮胁迫的耐性,具有重要的应用价值。初步分析了SiATG8a拟南芥同源基因AtATG8a调控植物自噬过程的作用机制。