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目的研究miR-628-5p在EV71诱导的固有免疫反应中的作用,为阐明EV71与宿主的交互作用提供理论依据。方法1.收集EV71(MOI=1,24 h)感染组和未感染组的RD细胞,感染24 h后,进行RNA-Seq得到EV71感染RD细胞的miRNA表达谱,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证测序结果。利用qRT-PCR验证miR-628-5p在不同EV71感染时间(0h,6 h,12 h,24 h)和感染剂量(MOI=0,1,5,10)下的上调作用。2.收集不同感染时间(0h,6 h,12 h,24 h,48 h)和不同感染剂量(MOI=0,1,2.5,5,7.5,10)的RD细胞,qRT-PCR检测EV71对I型干扰素的调控作用。利用miR-628-5p mimic(50 nM)转染RD细胞、构建IFNβ1启动子基因双荧光素酶报告基因、qRT-PCR等方法,检测miR-628-5p对EV71在RD细胞中诱导的IFNβ1的调控作用。MTT实验,JC-1染色,TUNNEL染色检测miR-628-5p对RD细胞的凋亡作用。3.利用miRNA靶基因预测数据库TargetScan和miRbase筛选miR-628-5p的靶基因TRAF3,双荧光素酶报告实验、免疫荧光、Western blot(WB)验证miR-628-5p与TRAF3的靶向关系。WB检测EV71感染后TRAF3下游蛋白NF-κB-p65、IRF3的表达以及VP1和凋亡蛋白的表达水平。利用miR-628-5p mimic(50 nM)和 miR-628-5p inhibitor(250 nM)转染 RD 细胞,WB、qRT-PCR检测TRAF3及IFNβ1和EV71复制的表达,验证miR-628-5p是否通过TRAF3介导的下游信号调控EV71诱导的IFNβ1的表达进而影响EV71的复制。4.利用TRAF3过表达载体(2500 ng)转染RD细胞,WB检测TRAF3对下游基因p65和IRF3以及VP1和凋亡蛋白的影响。免疫荧光用于观察TRAF3和下游蛋白p65和IRF3的交互作用。qRT-PCR检测TRAF3对EV71诱导的IFNβ1和EV71复制的影响。利用miR-628-5p mimic(50 nM)与TRAF3过表达载体(2500 ng)共转染入RD细胞,WB检测TRAF3介导的蛋白和VP1蛋白的表达,qRT-PCR检测IFNβ1和EV71复制的表达,观察TRAF3的过表达对miR-628-5p调控IFNβ1转录的变化,验证miR-628-5p通过靶向TRAF3调控EV71诱导的IFNβ1的转录。5.利用 miR-628-5p mimic NC,miR-628-5p mimic,miR-628-5p mimic NC+TRAF3 载体,miR-628-5p mimic+TRAF3 载体分别转染入 RD 细胞内,EV71感染(MOI=1)0h,6h,12 h,24 h后提取各组总蛋白、浆蛋白、核蛋白,WB检测各组TRAF3及下游基因p65和IRF3的表达,观察P65和IRF3在浆蛋白和核蛋白的表达。免疫荧光观察p65和IRF3的荧光强度,验证miR-628-5p对靶基因介导的p65和IRF3核转运的影响。6.收集EV71感染患者以及出院后患者的血清,qRT-PCR检测患者血清中miR-628-5p的表达,利用Pearson相关分析研究miR-628-5p与临床炎症指标和发病天数的相关性,将轻、重症患者分为4个亚组(发病后1、2、3、≥4天)观察miR-628-5p在手足口病进程中的作用。结果1.EV71感染RD细胞后,miRNA测序和qRT-PCR结果均显示miR-628-5p的表达显著上升,在RD细胞、293T细胞、HMEC-1细胞miR-628-5p的表达均上调且与EV71感染时间和感染MOI均呈依赖趋势。2.EV71感染RD细胞后,IFNβ1的表达在感染后24 h达到高峰。转染miR-628-5p mimics后感染EV71,与阴性对照相比IFNβ1的表达下降且IFNβ1启动子活性被抑制。MTT结果显示,转染miR-628-5p mimics组的细胞活力比阴性对照组低。JC-1染色,TUNNEL染色结果显示转染miR-628-5p mimics组的细胞凋亡数比阴性对照组多。3.利用生物信息学软件预测TRAF3是miR-628-5p的靶基因,EV71感染后TRAF3的表达下调,这与miR-628-5p的上调是一致。miR-628-5p mimic和野生型荧光素酶报告基因载体共转染,荧光活性明显被抑制。EV71感染后TRAF3、p65、IRF3蛋白表达随着感染时间和感染剂量明显下调,Cleave-Caspase3上调,凋亡增加。转染miR-628-5pmimic后,TRAF3、p65、IRF3蛋白表达下降,VP1,Cleave-Caspase3表达增加,TRAF3和IFNβ1 mRNA表达下调,EV71复制增加。4.利用靶基因过表达载体转染RD细胞,WB检测TRAF3表达明显升高,p65和IRF3变化不明显,VP1和Cleave-Caspase3表达明显下降,IFNβ1 mRNA表达升高,EV71复制减少;免疫荧光发现TRAF3可促进p65和IRF3向核内转运;利用miR-628-5p mimic与靶基因过表达载体共转染入RD细胞,过表达TRAF3减弱了 miR-628-5p mimic抑制IFNβ1的转录和促进EV71复制的效应。5.通过对细胞总蛋白、浆蛋白、核蛋白分析发现在核蛋白中,与NC组相比,miR-628-5pmimic转染后p65和IRF3的表达降低;过表达TRAF3后,P65和IRF3在核蛋白的表达升高,与miR-628-5p共转染后表达再次降低但是比mimic组蛋白表达高。免疫荧光观察到同样的结果。6.qRT-PCR检测EV71感染患者血清中miR-628-5p的表达,发现与轻症和健康对照相比,重症患者血清中miR-628-5p的表达升高且治疗后血清中miR-628-5p表达水平降低。利用Pearson相关分析得到miR-628-5p在发病后1天和3天的表达在重症病例中明显高于轻症者。miR-628-5p与白细胞数(r=0.276,P=0.002)、淋巴细胞数(r=0.19,P=0.04)、中性粒细胞数(r=0.312,P=0.0006)、单核细胞数(r=0.558,P<0.0001)、C 反应蛋白(r=0.09,P=0.286)、总蛋白(r=0.34,P=0.0002)呈正相关。结论1.miR-628-5p通过靶向TRAF3信号抑制I型干扰素的表达,促进EV71复制。2.miR-628-5p可能参与手足口病的重症化。