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研究背景:骨骼发育不良（Skeletal Dysplasia,SD）是一类影响骨与软骨发育的遗传性骨骼畸形。弯肢发育不全（Campomelic dysplasia,CD）是一种由SOX9基因突变引起的常染色体显性遗传的SD,其临床特征是先天性的尤其发生在下肢长骨短缩、弯曲、肩胛骨发育不良、髂翼狭窄、胸椎椎弓根矿化不足等。由于胸腔狭小和气管、支气管发育不全有关的呼吸功能不全使得患者通常在出生后的一年内死亡。SOX9基因突变导致的CD通常会伴随46,XY性别反转。有10%CD患者不存在长骨弯曲,称为AcampomelicCD（ACD）。尽管目前研究已经证实CD以及ACD均是由S0X9基因突变引起,但是具体的作用机制尚未研究清楚。先天性椎体畸形（congenital vertebral malformations,CVM）是属于骨科范畴的SD,以先天性脊柱侧凸（congenital scoliosis,CS）为主,是一种严重的先天脊柱发育异常,是造成青少年残疾的主要疾病之一。CVM可单纯表现为脊柱椎体畸形,同时脊柱畸形也可能只是许多综合征性CVM的临床表现之一。CD/ACD常合并脊柱畸形,具有较强的致残、致畸率。由于临床医生缺乏对综合征性CVM的充分认识,可能会导致在诊疗过程中对此类患者的漏诊或误诊。因此,在CVM患者中开展SOX9基因的相关研究对提高综合征性脊柱畸形诊断率以及探究SOX9基因相关骨骼畸形的致病机制具有重要意义。研究目的:1.对CVM患者进行全外显子测序（Wholeexomesequencing,WES）,筛选SOX9候选致病位点。2.体外实验验证候选突变位点的功能改变,探寻SOX9致病的潜在病理机制。3.构建基因编辑小鼠模型,深入研究SOX9基因突变导致CVM的致病机理,为CVM的临床诊断和精准靶向治疗提供新的方向和思路。研究方法:我们对 DISCO 研究组（Deciphering Disorders Involving Scoliosis and COmorbidities）收集的570例CVM患者以及2000例无脊柱畸形人群的血样进行WES测序,测序得到的原始数据使用课题组自主研发的分析流程（PUMchPipeline,PUMP）进行分析。结合生物信息学分析以及病人临床表型筛选出高度可疑致病的SOX9突变位点,然后对相应的突变位点进行体外功能实验以明确其致病性。最后,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了Sox9基因突变小鼠模型,并采用组织病理学方法初步研究了Sox9基因突变小鼠脊柱及椎间盘的病理改变。研究结果:1.我们在570名CVM患者中,共发现7名患者携带5个相对致病性较高的SOX9错义突变（Missense）位点。它们分别为:Ile73Thr、Met113Leu、Ala133G1、Gly276Cys以及Met469Val。通过详细、系统的随访,我们发现携带Ile73Thr、Met113Leu及Ala133Gly突变的患者除了脊柱畸形外,还存在腭裂、小颌畸形等其他系统畸形。结合突变位点的生物信息学分析,我们怀疑此3位患者有可能为ACD患者,另外携带Gly276Cys以及Met469Val突变的患者均只表现为CS,以上两个突变很有可能是CS新致病突变位点。2.我们通过 Western Blot、Immunofluorescence、Luciferase 以及 EMSA 体外功能实验证实以上5个突变均为有害性突变。结合病人的临床资料、WES测序数据分析以及体外功能验证,我们认为携带Ile73Thr、Met113Leu以及Ala133Gly突变的三名患者符合ACD的分子诊断。另外,Gly276Cys以及Met469Val突变均尚未被国内、外文献报道,但是表现出了 SOX9反式激活作用下降,因此我们认为这两个突变为导致CS的新致病位点。3.我们通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Sox9基因D272Del突变小鼠模型。我们发现纯合突变Sox9del/del小鼠与我们队列里发现的Gly276Cys突变病人的表型一致,尾椎发生了脊柱侧凸畸形。椎体的ABH/OG染色发现小鼠尾椎椎体骨骼发育存在异常,椎间盘形态也发生改变。4.D272Del突变位置与我们病例组Gly276Cys突变病人的突变位点均位于Sox9的K2功能域,Luciferase实验也进一步验证D272del跟Gly276Cys一致,同样影响了 Sox9的反式激活作用,因此我们认为K2功能异常可能跟CS的形成密切相关。研究结论:本研究共发现7名患者携带5个致病性较高的SOX9错义突变位点。通过体外功能实验证实以上5个突变均为有害性突变,结合病人的临床表型,我们对3例之前临床诊断为CVM的患者给出了 ACD的分子诊断,同时证实了Gly276Cys以及Met469Val是导致CS的新致病位点。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了突变同样发生在K2功能域的D272del突变小鼠模型,该小鼠表现为尾椎椎体及椎间盘发育异常,Luciferase实验进一步证实该突变同样导致了 Sox9反式激活作用的下降。因此我们认为K2功能域异常跟CS形成具有重要关系。