论文部分内容阅读
研究背景和目的胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是目前死亡率最高的实体肿瘤之一。由于缺乏有效的早期检测指标，并且当疾病仅局限于胰腺时，大多数的患者并未出现临床症状，因此导致大多数的病人直到疾病的晚期才被诊断出来，而此时肿瘤已转移至其他器官，即使此时行外科手术切除，也不能获得满意的疗效。目前研究已经证实，胰腺癌主要是从几种癌前病变中的一种进展而来的，其中主要的是胰腺上皮内瘤样病变（PancreaticIntraepithelial Neoplasias，PanINs）。因此，深入研究胰腺癌前病变的分子变化，有助于早期诊断胰腺癌，从而在胰腺癌前病变阶段进行治疗。MUC4是一种跨膜黏蛋白，在正常胰腺中不表达，而在胰腺癌中过表达。越来越多的研究表明，MUC4可能作为胰腺癌一种新的诊断、预后和治疗靶点。由于目前国内关于其在胰腺癌前病变中表达情况的研究较少，因此，对于其在胰腺癌前病变中的作用机制还不是很清楚。本实验通过免疫组化方法检测MUC4蛋白在各种胰腺组织(Normal、PanINs及PC)中的表达，从而揭示MUC4蛋白在胰腺癌演进过程中的变化，为进一步研究MUC4蛋白在胰腺癌前病变中的作用机制提供支持。现已有很多研究表明，MUC4在胰腺癌细胞中过表达，而在正常胰腺癌细胞中不表达，这说明MUC4参与了胰腺正常细胞恶变的过程。但是国内对于其与胰腺癌细胞活性关系的研究则较少，MUC4过表达与胰腺癌细胞增殖和凋亡、浸润和转移等活性的研究则更少。CD18/HPAF是一种具有高度侵袭性的胰腺癌细胞系。本实验通过将MUC4过表达的CD18/HPAF （CD18/HPAF-Scr）与MUC4沉默的CD18/HPAF（CD18/HPAF-siMUC4）进行比较，从而揭示MUC4过表达与胰腺癌细胞增殖和凋亡、浸润和转移等活性的关系，为进一步研究MUC4蛋白作为胰腺癌治疗靶点的机制提供支持。研究方法1、通过免疫组化实验检测MUC4蛋白在各种胰腺组织(Normal、PanINs及PC)中的表达。2、通过MUC4-特定短发夹RNA的稳定表达使CD18/HPAF中MUC4蛋白沉默表达。3、通过Western blotting和免疫荧光技术分析检测CD18/HPAF-siMUC4细胞、CD18/HPAF-Scr细胞以及CD18/HPAF中MUC4蛋白表达情况。4、通过胸腺嘧啶核苷双阻断法，将细胞同步在G1-S期；对细胞进行碘化丙啶（PI）染色，通过流式细胞技术检测CD18/HPAF-siMUC4细胞和CD18/HPAF-Scr细胞的细胞周期变化及细胞增殖情况。5、通过膜联蛋白V和碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法对细胞进行染色，然后用流式细胞技术检测CD18/HPAF-siMUC4细胞、CD18/HPAF-Scr细胞及未进行染色细胞的细胞凋亡情况。6、通过细胞体外跨膜实验分别检测CD18/HPAF-siMUC4细胞和CD18/HPAF-Scr细胞的浸润和转移活性。实验结果1、免疫组化实验检测MUC4蛋白在各种胰腺组织中的表达结果表明，MUC4蛋白在从正常胰腺到PanIN-1到PanIN-2到PanIN-3再到PC的演进过程中，其表达随着组织异型程度的增加而增加。差异有统计学意义。2、 Western blotting和免疫荧光技术分析结果表明，与对照细胞相比，在CD18/HPAF-siMUC4中MUC4表达下调了大约80％。免疫荧光技术观察的结果也与Western blotting分析一致，进一步证实，与对照细胞相比，在CD18/HPAF-siMUC4细胞中，MUC4的表达明显减少了。3、胸腺嘧啶核苷双阻断法+流式细胞技术（碘化丙啶染色）检测结果表明，CD18/HPAF-Scr细胞进入S期的总比例为42.51％，相比之下，CD18/HPAF-siMUC4细胞为17.71％。说明MUC4-过表达（CD18/HPAF-Scr）细胞有着更高的增殖率，这也表明，MUC4过表达使得CD18/HPAF细胞的增殖数量增多。4、流式细胞技术（膜联蛋白V-碘化丙啶染色）检测结果表明，CD18/HPAF-siMUC4细胞的凋亡指数近两倍于CD18/HPAF-Scr细胞，而坏死指数两者却相差无几。这表明MUC4过表达有利于CD18/HPAF胰腺癌细胞存活。5、细胞体外跨膜实验结果表明，MUC4-沉默（CD18/HPAF-siMUC4）细胞侵入基底膜的数量只有对照（CD18/HPAF-Scr）细胞数量的近三分之一。这表明，MUC4沉默表达后，CD18/HPAF细胞的侵袭能力大大下降。研究结论MUC4蛋白表达伴随着胰腺恶变的整个过程；MUC4蛋白的表达水平随着组织异型程度增加而增加，提示其对胰腺癌的演进有促进作用；与MUC4-沉默细胞相比，MUC4-过表达细胞有着更高的增殖率，这提示MUC4蛋白对CD18/HPAF胰腺癌细胞的无限制生长有关联；与MUC4-过表达细胞相比， MUC4-沉默细胞的凋亡指数则更高，这提示，MUC4蛋白能促进CD18/HPAF胰腺癌细胞的存活；在细胞侵袭能力方面，当MUC4沉默表达后，CD18/HPAF胰腺癌细胞的侵袭性大大下降。在MUC4蛋白表达沉默后，CD18/HPAF胰腺癌细胞增殖和凋亡、浸润和转移等活性的变化提示MUC4可作为胰腺癌一个潜在的治疗靶点。