本研究首先采用了PCR及酶切的方法研究了MAGE-A亚型在5种食管鳞状细胞癌细胞系的基因表达谱，探讨了MAGE-A亚型在食管癌细胞中表达的特点和模式;通过去甲基化试剂地西他滨的作用，测定食管癌肿瘤细胞的活性、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞周期变化，及侵袭相关蛋白和信号通路蛋白的表达变化，研究了地西他滨对食管癌肿瘤细胞MAGE-A表达谱的调节作用，及其对肿瘤细胞增殖和侵袭能力的影响;利用siRNA技术沉默Eca109和KYSE170细胞中的MAGE-A基因，研究了MAGE-A基因在食管癌肿瘤细胞中的生物学功能，即对肿瘤细胞增殖活性、迁移侵袭能力和侵袭相关蛋白分子、信号通路蛋白表达的变化;探讨了MAGE-A在食管癌肿瘤细胞中的生物学作用及其机制。主要分三部分展开研究:　　第一部分 五种食管鳞状细胞癌细胞MAGE-A亚型基因表达谱　　目的:检测5种食管鳞状细胞癌细胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)中MAGE-A1，A2，A3，A4，A6，A8，A9，A10，A11的基因表达情况。　　方法:对于MAGE-A8，A9，A10，A11，采用单独设计引物进行普通PCR进行基因表达鉴定;对于MAGE-A1，A2，A3，A4，A6采用巢式PCR扩增共同片段，并利用扩增片段内不同限制性内切酶位点进行酶切产生大小不同的片段进行MAGE-A亚型进行表达鉴定。　　结果:1.五种食管鳞状细胞癌细胞系，每种至少表达二种MAGE-A亚型基因。　　2.五种食管鳞状细胞癌细胞系，MAGE-A亚型的表达呈多重表达特征。　　3.五种食管鳞状细胞癌细胞系表现为异质性，其MAGE-A亚型的表达各不相同。　　4.五种食管鳞状细胞癌细胞系中，MAGE-A2表达率为80％;MAGE-A3为40％;MAGE-A8为20％;MAGE-A9为100％;MAGE-A10为80％;MAGE-A11为40％。　　结论:1.MAGE-A亚型在食管鳞状细胞癌细胞系中有较高表达率。　　2.MAGE-A亚型在食管鳞状细胞癌细胞系中表达呈多重性，食管癌肿瘤细胞表现为异质性。　　3.MAGE-A2、MAGE-A9、MAGE-A10表达率较高，分别为80％、100％和80％。提示:这些分子可作为食管癌肿瘤免疫治疗的共同靶点，有利于提高免疫治疗效果。　　第二部分 地西他滨对MAGE-A表达的调节及其对肿瘤细胞功能的影响　　目的:检测地西他滨对食管癌肿瘤细胞Eca109中MAGE-A1，A2，A3，A4，A6，A8，A9，A10，A11基因表达的调节作用;同时测定低浓度地西他滨对Eca109细胞增殖、迁移侵袭及细胞周期的影响。　　方法:对于MAGE-A8，A9，A10，A11，采用单独设计引物进行普通PCR进行基因表达鉴定;对于MAGE-A1，A2，A3，A4，A6采用巢式PCR扩增共同片段，并利用扩增片段内不同限制性内切酶位点进行酶切，产生的大小不同片段可进行MAGE-A亚型基因表达的鉴定。低浓度地西他滨处理后，利用MTT方法测定肿瘤细胞增殖能力;利用细胞划痕实验测定细胞迁移能力;利用侵袭小室实验测定细胞侵袭能力;利用细胞流式分析技术测定肿瘤细胞周期变化;利用蛋白印迹技术检测地西他滨处理后肿瘤细胞中侵袭相关蛋白MMP2和信号通路蛋白NF-κB的表达情况。　　结果:1.地西他滨调节MAGE-A亚家族成员在食管癌细胞Eca109的基因表达。　　2.地西他滨抑制Eca109细胞增殖活性。　　3.地西他滨抑制Eca109细胞的迁移。　　4.地西他滨抑制Eca109细胞的侵袭。　　5.地西他滨诱导Eca109细胞周期G2/M期阻滞。　　6.地西他滨降低了Eca109细胞NF-κ B2和MMP2的表达。　　结论:1.低剂量地西他滨能够抑制Eca109细胞增殖活性，同时低剂量地西他滨诱导了肿瘤细胞发生细胞周期G2/M期阻滞。提示:低剂量地西他滨诱导Eca109肿瘤细胞发生细胞周期阻滞，可能导致了肿瘤细胞增殖活性的降低。　　2.低剂量地西他滨能够降低Eca109细胞迁移和侵袭的能力，同时处理组NF-κ B2和MMP2蛋白表达降低。提示:低剂量地西他滨有可能通过降低Eca109细胞MMP2蛋白表达抑制肿瘤细胞迁移侵袭能力，而NF-κB2信号通路有可能参与了该过程。　　3.低剂量地西他滨诱导Eca109细胞中MAGE-A8和MAGE-A4的表达，增加了MAGE-A亚型肿瘤免疫治疗抗原靶点。　　4.低剂量地西他滨联合MAGE-A靶点免疫治疗晚期食管鳞状细胞癌，有可能成为晚期食管癌患者治疗的新策略。　　第三部分 MAGE-A的生物学功能及其机制　　目的:检测MAGE-A在食管癌肿瘤细胞Eca109和KYSE170中，其对细胞增殖、迁移、侵袭的生物学功能影响，并探讨其作用机制。　　方法:选择含有针对MAGE-A亚家族保守基因的6种siRNA混合物，利用siRNA沉默技术，研究MAGE-A亚型的生物学功能。采用普通PCR测定MAGE-A8，A9，A10，A11的基因表达沉默效果，采用巢式PCR扩增共同片段测定MAGE-A1，A2，A3，A4，A6基因沉默效果;采用蛋白印迹测定MAGE-A亚型蛋白表达沉默效果。确定MAGE-A siRNA能有效沉默MAGE-A后，利用MTT方法测定肿瘤细胞增殖能力;利用细胞划痕实验测定细胞迁移能力;利用侵袭无胶小室和有胶小室实验测定细胞侵袭能力。利用蛋白印迹技术测定肿瘤细胞内MMP2蛋白和信号通路蛋白p-p38蛋白表达情况;采用p38 MAPK信号通路抑制剂SB203580，检测p38信号通路是否参与了MAGE-A沉默后肿瘤细胞发生的生物学效应改变。　　结果:1.MAGE-A siRNA能够抑制了MAGE-A亚型基因和蛋白表达。和对照组si-scramble相比，转染了50nM和100nM MAGE-A siRNA的Eca109和KYSE170细胞，其MAGE-A的mRNA和蛋白的表达均降低。转染100nM MAGE-A si-RNA的细胞组，MAGE-A亚型蛋白表达降低更明显。提示:实验采取100 nM转染siRNA。　　2.沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞的增殖。和对照组相比，转染100nM MAGE-A siRNA48小时后，Eca109和KYSE170细胞增殖活性，分别降低了11.26％（P＜0.05）和12.61％(P＜0.05)。　　3.沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞迁移能力。和对照组相比，转染100nM MAGE-A siRNA后，0-24小时迁移能力分别降低了32.97％和41.15％(P＜0.05)。　　4.沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞的侵袭能力。和对照组相比，转染100nM MAGE-A siRNA后，两种肿瘤细胞的侵袭能力在无胶小室中降低了32％和44.55％(P＜0.05);在有胶小室中降低了51.5％和39.48％（P＜0.05）。　　5.沉默MAGE-A基因抑制食管癌细胞中MMP2、c-Myc和p-p38的表达。转染100nM MAGE-A siRNA后，Eca109细胞的c-Myc、MMP2表达分别降低19.12％、61.11％(P＜0.05);KYSE170细胞c-Myc表达降低了47.67％(P＜0.05)。食管癌细胞Eca109和KYSE170中磷酸化p38水平均降低，分别降低了27.6％和39.45％(P＜0.05)，提示:P38 MAPK信号通路可能参与了MAGE-A基因沉默引发的肿瘤细胞生物学功能的改变，如细胞增殖活性降低和侵袭能力抑制;肿瘤细胞中MMP2或c-Myc分子可能是p38信号通路的效应分子。　　6.用SB203580阻断p38MAPK信号通路途径抑制食管癌细胞侵袭能力、降低细胞MMP2、c-Myc的表达。和对照组相比，2μM SB203580处理48小时后，穿过基质胶包被小室的肿瘤细胞数量显著减少，侵袭能力分别降低了31.67％和28.2％(P＜0.05);Eca109和KYSE170细胞中c-Myc的表达都出现了降低，分别降低了27.65％和28.2％(P＜0.05);Eca109细胞中MMP2降低了19.3％(P＜0.05)。SB203580处理组，P38信号通路蛋白p-p38和NF-κ B2信号通路蛋白p100、p52表达没有显著性变化。提示:p38MAPK信号通路阻断后，细胞生物学效应的改变和沉默MAGE-A基因后效应改变相一致;肿瘤细胞中MMP2和c-Myc可能是p38MAPK信号通路的效应分子;沉默MAGE-A基因有可能通过p38MAPK信号通路途径，引发MMP2和c-Myc的降低，抑制了食管癌肿瘤细胞的侵袭能力。　　结论:1.沉默MAGE-A抑制食管癌细胞的增殖活性和迁移侵袭能力。　　2.沉默MAGE-A抑制食管癌细胞c-Myc和MMP2的表达。　　3.沉默MAGE-A抑制食管癌细胞p38 MAPK通路蛋白的表达。　　4.在食管癌细胞中，p38MAPK信号通路部分参与了MAGE-A沉默后肿瘤细胞迁移侵袭能力降低的生物学过程。　　5.沉默MAGE-A可能通过抑制食管癌细胞p38MAPK信号通路，降低表达了通路效应分子c-Myc和MMP2，从而抑制了食管癌细胞的增殖活性和迁移侵袭能力。