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目的:本研究通过构建犬年轻恒牙慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis,CAP)模型,使用改良的三联抗生素糊剂行根管消毒后刺激根尖出血,添加自体牙髓干细胞和富血小板纤维蛋白,并通过影像学、机械力学、组织学检测探究根管内新生组织的构成,以及通过添加不同的因子,探讨改进该法的可能性。 方法:健康6月龄Beagle犬4只,选择双侧上颌第3切牙作为DPSCs(dental pulp stem cells)来源,采用并改良Gronthos等报道的方法进行Beagle犬原代cDPSCs的分离、培养,并进行表型鉴定及GFP(green fluorescent protein)基因的转染。参照Choukroun的方法制备自体PRF(platelet-rich fibrin)。每只犬上颌双侧第2、3前磨牙,下颌双侧第2、3、4前磨牙作为实验牙,成功建立CAP模型后采用改良的三联抗生素糊剂进行根管消毒。实验分为空白对照组和4组实验组,A组:blood clot组,B组:PRF组,C组:cDPSCs组,D组:PRF+cDPSCs组。在刺激根尖出血的基础上添加cDPSCs和PRF,并用MTA(mineral trioxide aggregate)与复合树脂封闭冠部。3个月后,采用平行投照的方法拍摄根尖X线片,观察CAP的愈合情况,并通过Image J软件测量术前术后牙根长度和管壁厚度的变化;使用万能材料试验机测量实验牙的抗折强度,通过与正常牙的对比,评估该法对恢复牙齿抗折强度的效果;通过对实验牙进行HE染色,探明根管内新生组织的组成成分及来源。 结果: (1)cDPSCs分离、培养、鉴定结果:Beagle犬牙髓组织分离3 d后可观察到cDPSCs贴壁生长。cDPSCs的增殖曲线符合细胞对数生长曲线。细胞表面标记物 CD146、STRO-1和Vimentin检测均表达阳性。 (2)cDPSCs多向分化诱导结果:cDPSCs的成牙本质/骨分化诱导,茜素红染色呈强阳性,可见有大量暗红色矿化结节散在分布。cDPSCs的成脂分化诱导,油红O染色阳性,可见暗红色圆形油脂滴,呈串珠状。 (3)GFP基因转染结果:GFP转染48 h后实验组细胞的转染效率已达到80%~90%,但与对照组相比,实验组细胞的生长增殖速率有所减缓,且形态发生一定的改变。 (4)改良的TAP(triple antibiotic paste)根管消毒结果:TAP消毒3 W后,38颗实验牙仍有3颗炎症未控制。根管冲洗液进行细菌学培养,在需氧条件下均无菌落形成,而在厌氧环境中,有一个根管来源的培养基出现白色菌落,革兰氏染色呈红色。 (5)根尖X线片结果:实验组都出现了根尖暗影愈合,根尖闭合趋势,但差别无统计学意义(P>0.01)。 (6)Image J软件测量结果:在牙根增加长度、管壁增加厚度上,4组实验组与对照组间存在显著性差异(P<0.01),实验组均低于对照组,各实验组间的差异无统计学意义(P>0.01)。 (7)抗折强度测试结果:4组实验组与对照组间存在显著性差异(P<0.01),4组实验组的折裂力值均低于对照组。B组、C组、D组与A组间的差异无统计学意义(P>0.01)。 (8)HE染色结果:实验牙根管内均有血管、类牙骨质、类骨以及类牙周膜等组织生成,但未发现牙本质的形成。4个实验组在根管内新生物的组成和数量上无差别。荧光显微镜下未发现有绿色荧光的组织或细胞。 结论: (1)采用并改良 Gronthos等的方法分离、培养 cDPSCs具有很强的自我增殖能力和多向分化能力; (2)改良的TAP首次运用于动物实验中,对感染根管有良好的消毒作用; (3)首次运用慢病毒载体介导GFP基因转染cDPSCs的方法并不适用于牙髓血管再生术中新生组织来源的研究; (4)在传统牙髓血管再生术刺激根尖出血的基础上添加自体PRF和cDPSCs3个月后,证实了根管内的新生物的构成仍主要是类牙骨质、类骨及类牙周膜等组织,未发现有牙本质的形成;牙抗折强度恢复到正常水平的42%~64%。本实验观察到PRF和cDPSCs无明显促进其疗效的作用。