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目的:通过酶解将海洋软体动物蛋白转化为功能肽是提高其利用效率的有效途径。但由于海洋软体动物蛋白结构庞大复杂,多以糖蛋白形式存在,水解位点被糖基侧链屏蔽,难以在温和条件下水解成功能域结构完整的功能肽。实验室前期针对此共性问题对产酶海洋微生物开展筛选和研究。发现了海洋来源的芽孢杆菌SCSIO 06063发酵所产的胞外蛋白酶在温和条件下酶解扇贝蛋白,产物具有显著抗氧化性,表现了良好的应用潜力。本研究在此基础上,对SCSIO 06063的产酶发酵进行优化,探索规模化制备SCSIO 06063蛋白酶的最优条件,并且深入研究其催化酶解扇贝蛋白的产物,明确其中抗氧化有效成分,为形成完整的新酶应用技术奠定基础。方法:1、发酵条件的优化:以蛋白酶活为检测目标,优化海洋芽孢杆菌SCSIO 06063产蛋白酶的培养条件。利用单因素法,在LB培养基的基础上,优化碳源、氮源、金属离子和盐度。考察温度、初始PH、接种量、转速对发酵产酶的影响。采用响应面法对影响产酶的主要因素进行优化,并在最佳优化条件下制备酶溶液和扇贝酶解液。2、扇贝SCSIO 06063酶解液中抗氧化肽的研究:以DPPH及OH自由基清除率评价抗氧化活性,采用超滤、反相高效液相色谱对酶解液进行反复分离,纯化其中抗氧化肽类,并用MALDI-TOF为主的波谱技术鉴定这些肽类的氨基酸序列。结果:1、通过研究发现,SCSIO 06063产酶发酵的最适氮源是尿素,最适碳源是麦芽糖,对产酶发酵影响最大的三个因素是麦芽糖、尿素和CaC12。在单因素优化的基础上,采用三因素三水平响应面法优化培养基组分,当麦芽糖浓度为32.21g/L,尿素浓度为9.85g/L,CaC12浓度为2.39g/L时,可获得理论蛋白酶酶活为176.22U/mL,为了验证模型的准确性,在上述理论最佳组合浓度下,进行三组平行实验,得出平均蛋白酶酶活为169.96U/mL,与预测值误差为3.55%,该模型可用于预测菌株SCSIO06063发酵产蛋白酶。最终确定了发酵的最优培养基组成为:在LB培养基的基础上,添加32.21g/L麦芽糖,9.85g/L 尿素,2.39g/LCaC12,1g/LMgC12,及 20g/LNaCI。在最优条件下,10L发酵罐发酵酶活达到456.72U/mL,比优化前提高了 3.45倍。2、扇贝酶解物经超滤,反复RP-HPLC分离洗脱后,分离纯化最终获得三个肽类,SHE-n-1,3,和5。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定了这三个肽类的结构,分别为His-Ala-Ile-Ile-Met-Met-Val(SHE-II-1)、Leu-Asn-Pro-Lys-Leu-Ile-Met-Val(SHE-II-3)、Met-Ile-Leu-Ile-Leu-Phe-Arg(SHE-II-5)。NCBI数据库中blast检索未发现SHE-II-1的同源序列,表明这是一个新结构肽类。用DPPH自由基清除实验评价抗氧化性,SHE-II-1,3,和5的清除率分别为:51.60%,55.42%和53.44%。结论:海洋来源芽孢杆菌SCSI006063所产的蛋白酶经优化培养基成分和培养条件后酶活得到了较大提高,利用粗酶液酶解扇贝所得的酶解物经分离纯化后,有新型结构肽段的产生,本研究为高效利用蛋白酶制备活性肽以及优化产酶工艺提供了有用的信息。