论文部分内容阅读
目的:探究在肝癌中LncRNA H19对化疗多药耐药性的影响及相关作用通路与苦参素逆转肝癌耐药作用的新机制。方法:(1)四甲基偶氮唑盐(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)法检测HepG2/ADM转染后对化疗药5-Fu、ADM、CDDP敏感性的变化。(2)采用慢病毒构建及质粒转染技术,抑制及增强细胞中H19的表达后,在HepG2/ADM及HepG2细胞中,检测对化疗药物敏感性的变化,并采用qPCR法检测转染前后H19的表达,应用Western blot检测转染前后P-gp、ZEB1及EC蛋白的表达变化,用流式细胞术检测转染前后细胞凋亡的变化情况,探讨H19影响肝癌化疗药耐受性的影响通路。(3)应用qPCR检测苦参素作用后H19的表达变化,用Western blot法检测P-gp、ZEB1及EC蛋白的表达变化,探讨苦参素逆转肝癌化疗耐药的可能分子机制。结果:(1)qPCR检测结果提示:HepG2/ADM细胞中H19表达量为4.582±0.217,HepG2细胞的相对表达为3.352±0.209,NC组分别为:4.386±0.236、2.950±0.109,低表达组为:0.871±0.143,高表达组为:4.852±0.212,两组相比差异有统计学意义(P<0.001),转染H19后,高表达组对化疗药5-Fu、ADM、CDDP的IC50分别为25.90±7.01,2.12±0.39,及4.67±1.85,低表达组对各化疗药的IC50分别为19.58±3.01,2.47±0.91,及9.64±1.74,实验组各化疗的IC50值与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)H19逆转耐药机制研究:抑制H19的表达后,流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,低表达组细胞凋亡率(20.79±2.22)%,高于阴性对照组(4.16±0.23)%,细胞凋亡率从低到高顺序为空白对照组<阴性对照组<低表达祖,统计学分析显示,低表达组与空白组及阴性组两组间比较差异有统计学意义(F=165.425,P<0.001),进一步行LSD相互比较差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示,低表达组ZEB1蛋白表达水平下降,EC蛋白表达有所增强(P<0.05),而高表达组的表达结果均与低表达组相反,且ZEB1蛋白表达高于对照组,EC蛋白低于对照组(P<0.05)。(3)Western blot结果显示P-gp、ZEB1蛋白在耐药细胞HepG2/ADM中较亲本细胞HepG2表达量高(P<0.05)。(4)qPCR结果显示,在HepG2/ADM+OMT组中H19相对表达量与HepG2/ADM组的对比无明显变化,为4.713±0.391差异无统计学意义(P=0.550)。Western blot结果显示,苦参素作用后HepG2/ADM+OMT组P-gp、ZEB1蛋白表达均降低,EC蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:1.在肝癌耐药细胞HepG2/ADM及亲本细胞HepG2中H19的表达存在差异,HepG2/ADM细胞中H19的表达水平明显高于HepG2细胞;其表达的变化可调控肿瘤细胞化疗耐药性的改变。2.在HepG2/ADM及HepG2中,下调H19的表达,能抑制EMT作用,促进肝癌细胞的凋亡提高化疗的敏感性。3.在HepG2/ADM及HepG2中,H19可作用于P-gp、ZEB1、EC,通过EMT作用调控肝癌细胞的化疗耐药性。4.苦参素可部分逆转肝癌细胞对化疗药的多药耐药性,其机制不是通过作用于H19发生,可能是通过影响ZEB1及EC表达进而削弱上皮间质转化作用,抑制P-gp的表达而逆转肝癌细胞中化疗耐药性。