目的:首先建立小鼠内毒素耐受的模型,研究内毒素耐受后的小鼠脾脏组织TLR4/IRAK-4(Toll样受体4)信号通路中相关正性因子白细胞介素-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)及相关负性因子肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNF receptor associated factors 3,TRAF3)的表达变化。方法:1、实验动物的喂养:一共84只ICR小鼠(日龄35土2天,体重25土5g),饲养于相同的环境(温度、湿度及食物等均相同)中,适应性喂养一周。2、实验动物分组:将84只ICR小鼠采用随机数字表法随机分配到以下三组中,即内毒素耐受组、非内毒素耐受组、空白对照组,每组28只小鼠。3、建立动物模型:(1)、预先小剂量内毒素刺激:采用腹腔注射的方法,对内毒素耐受组小鼠腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides LPS)0.5mg/kg(小剂量),非内毒素耐受组及空白对照组小鼠分别予以等体积的生理盐水进行腹腔注射。(2)第二次大剂量内毒素刺激:以上小剂量脂多糖腹腔注射结束24小时后,再次对内毒素耐受组予以腹腔注射脂多糖5mg/kg(大剂量),同时非内毒素耐受组小鼠也予以腹腔注射脂多糖5mg/kg,而空白对照组小鼠仍然予以相同体积的生理盐水进行腹腔注射。4、留取标本与指标检测:(1)、分别于第二次大剂量内毒素注射前(0小时),注射后3小时、6小时、24小时按照随机数字表法于每组中选取7只小鼠,采用摘除眼球的方法取得小鼠血液,予以离心后取血清,采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测各组小鼠不同时间点血清中细胞因子白介素-10(interleukin-10;IL-10)的表达情况。(2)、眼球取血后,立即处死小鼠,迅速取出小鼠的脾脏组织,置于多聚甲醛固定液中固定保存,采用石蜡切片,采用免疫组织化学的方法检测各组小鼠不同时间点脾脏组织中IRAK-4及TRAF3的表达情况,同时使用光镜观察各组小鼠脾脏组织在不同时间点的病理变化。结果:1、各组小鼠日常行为的观察:内毒素耐受组的28只小鼠于第一次小剂量内毒素(0.5mg/kg)注射后不同程度的出现活动减少、吃食物减少、毛发散乱等表现。而注射相同体积生理盐水的非内毒素耐受组及空白对照组内小鼠的行为活动无明显变化。第二次大剂量内毒素(5mg/kg)注射后,内毒素耐受组及非内毒素耐受组小鼠均出现明显的少吃、少动、离群、毛发散乱等表现,且这些表现较小剂量内毒素注射后更为明显(非内毒素耐受组有小鼠出现腹泻、口唇发绀表现)。而第二次注射相同体积生理盐水的空白对照组小鼠仍无明显变化。2、小鼠血清IL-10的表达情况:(1)、第二次大剂量内毒素注射前(0小时),对小鼠血清IL-10进行三组组间比较,内毒素耐受组的表达量高于非内毒素耐受组及空白对照组,这说明经小剂量内毒素注射后,小鼠体内的抑炎症细胞因子IL-10已经开始升高;非内毒素耐受组与空白对照组相比较,差异无统计学意义。(2)、第二次大剂量内毒素注射后的3小时、6小时及24小时,对小鼠血清IL-10进行三组组间比较,内毒素耐受组IL-10的表达量是大于非内毒素耐受组及空白对照组的;非内毒素耐受组IL-10的表达量又是大于空白对照组的;这说明对小鼠进行预先的小剂量内毒素注射后,再次予以大剂量内毒素刺激,小鼠血清中的抑炎症细胞因子IL-10的表达升高更为明显。(3)、对小鼠血清IL-10进行三组组内比较,内毒素耐受组及非内毒素耐受组的0小时分别与3小时、6小时、24小时相比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而3、6、24小时两两之间相比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。空白对照组在实验的各个时刻IL-10表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。3、小鼠脾脏组织病理变化:内毒素耐受组及非内毒素耐受组小鼠脾脏组织都出现不同程度的病理损伤,表现为脾脏充血,组织结构改变,红髓、白髓分界不轻,而内毒素耐受组的这种损伤变化明显轻于非内毒素耐受组;空白对照组则没有上述变化。这也可以说明在本实验中,内毒素耐受的小鼠模型的建立是成功的。4、小鼠脾脏组织IRAK-4的表达情况:(1)、对小鼠脾脏组织IRAK-4的表达情况进行三组组间比较:(1)、第二次大剂量内毒素注射前(0小时),小鼠脾脏组织IRAK-4的表达量三组间的差异均不具有统计学意义。(2)、第二次大剂量内毒素注射后的3小时、6小时,小鼠脾脏组织IRAK4的表达量三组间的差异均有统计学意义,且非内毒素耐受组的表达量高于内毒素耐受组及空白对照组,而内毒素耐受组的表达量又高于空白对照组。(3)、第二次大剂量内毒素注射后的24小时,非内毒素耐受组小鼠脾脏组织IRAK-4的表达量高于内毒素耐受组及空白对照组;内毒素耐受组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)、对小鼠脾脏组织IRAK-4的表达情况进行各组的组内比较:内毒素耐受组及非内毒素耐受组小鼠脾脏IRAK-4的表达在第二次大剂量内毒素注射后的3小时均已经升高,并且可以维持至6小时,于24小时已经有所下降。空白对照组的IRAK-4表达量在各个时间点之间的比较差异无统计学意义。5、小鼠脾脏组织TRAF3的表达情况:(1)、对小鼠脾脏组织TRAF3的表达情况进行三组组间比较:(1)、第二次大剂量内毒素注射前(0小时),小鼠脾脏组织TRAF3的表达量三组间的差异均不具有统计学意义(P>0.05)。(2)、第二次大剂量内毒素注射后的3小时、6小时,小鼠脾脏组织TRAF3的表达量三组间的差异均有统计学意义(P<0.05),且内毒素耐受组的表达量高于非内毒素耐受组及空白对照组,而非内毒素耐受组的表达量又高于空白对照组。(3)、第二次大剂量内毒素注射后的24小时,内毒素耐受组小鼠脾脏组织TRAF3的表达量高于非内毒素耐受组及空白对照组;非内毒素耐受组与空白对照组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。(2)、对小鼠脾脏组织TRAF3的表达情况进行各组的组内比较:内毒素耐受组及非内毒素耐受组小鼠脾脏TRAF3的表达均在第二次大剂量内毒素注射后的3小时已经出现,并且可以维持至6小时,内毒素耐受组于24小时仍可维持6小时表达量,非内毒素耐受组于24小时已有所下降,但仍然存在。结论:1.对小鼠预先腹腔注射0.5mg/kg的内毒素,24小时后再次注射5mg/kg的内毒素,可以建立内毒素耐受的小鼠模型。2.内毒素耐受的小鼠血清中的抑炎症细胞因子IL-10的表达升高,且脾脏组织的病理损伤会减轻。3.内毒素耐受时小鼠脾脏TLR4/IRAK-4信号通路中正性调节因子IRAK-4表达下调,而负性调节因子TRAF3的表达上调,可能参与了内毒素耐受的形成。