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本论文分为四章。
第一章,前言综述。首先对食用真菌病毒进行了概述,主要介绍了食用真菌病毒的形态特征,食用真菌病毒的对宿主影响及其传播,食用真菌病毒的起源和复制。随后总结了食用真菌病毒的检测方法,包括传统的理化方法和现代分子方法。最后介绍了香菇病毒研究进展和鉴定方法。
第二章,从形状畸形的香菇菌丝体和子实体中成功分离到了两种香菇病毒粒子,其中一种为大小约30-40nm等轴对称球状病毒颗粒;另一种为大小约20×100-200nm的杆形病毒。杆形病毒含分子大小约8.0kb的双链RNA基因组,球状病毒含约1433bp和820bp的dsRNA。对8.0kb dsRNA部分序列进行克隆,并完成序列测定。通过序列分析发现,这两种病毒的部分基因组序列与GenBank中的已知核酸序列无明显的同源性。而通过NCBI的ORF Finder检索,发现8.0kb dsRNA部分序列预测的氨基酸与植物毛果杨染色质修复复合体亚单位和酵母RNA聚合酶有同源性,可能编码病毒RNA聚合酶或相关蛋白;而球状病毒的基因组序列没有发现较为明显的ORF。它们可能是新发现的食用真菌病毒。最后,我们根据8.0kb dsRNA部分序列设计特异性引物,提供了一种方便有效鉴定香菇病毒的RT-PCR方法。
第三章,为了确定我国分离的甘蓝夜蛾核型多角体病毒(MbMNPV)也具有广谱杀虫活性,通过室内感染实验表明,MbMNPV对棉铃虫和甜菜夜蛾均具有较好的杀虫活性,可用于防治这两种重要害虫。为了从分子水平上对我国分离的MbMNPV进行鉴定,我们根据已公布的MbMNPV-gp37基因及蓓带夜蛾核型多角体病毒增效蛋白基因(McNPV-enhancin)序列设计引物,通过PCR扩增出我国分离MbMNPV的gp37基因和enhancin基因部分序列,分别命名为MbMNPV-gp37-Y和MbMNPV-enhancin-Y1。经BLAST比对分析,结果显示,MbMNPV-gp37-Y与MbMNPV-gp37、McNPV-gp37都高度同源,且MbMNPV-enhancin-Y1与McNPV-enhancin,尤其是其B株enhancin基因具有很高的同源性。这些结果表明,我国分离的MbMNPV与国外分离的同类病毒及McNPV-B相似,即使经过替代宿主棉铃虫或甜菜夜蛾增殖,该病毒也没有变异。随后我们分别使用了pET28和pMALp2X+两种原核表达载体成功表达了gp37-Y蛋白,为gp37基因的功能研究奠定了基础。
第四章,甜菜夜蛾核型多角体病毒美国分离株(SeMNPV-M)和中国分离株(SeMNPV-Z)的基因组DNA经BamH I,EcoR I,EcoR.V,HindIII,Pst I,Sac I和Xho I核酸限制内切酶分析,显示两个分离株存在一定差别,但差异不十分明显。利用PCR方法对两个分离株的同源重复序列hrl进行扩增,结果表明,SeMNPV-M分离株hr1扩增产物是两条等分子量的DNA片段,分子大小约为1.5kb和1.4kb,显示它由两个基因型组成。SeMNPV-Z分离株hrl的PCR扩增产物仅有一条分子大小约1.5 kb的核苷酸片段,它由单基因型组成。SeMNPV-Z为一个不同于SeMNPV-M的独立地区分离株。