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米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）是一种临床新兴的条件致病菌,可造成新生儿和免疫缺陷人群菌血症、尿路感染等,近年来,被报道可引起蛙类歪头、白内障及内脏出血等症状,导致蛙出现暴发性死亡。米尔伊丽莎白菌感染对我国蛙类养殖业造成了巨大的经济损失。同时,该菌也可作为一种潜在的人畜共患菌,对人类健康具有潜在威胁。因此,建立一种准确、快速的米尔伊丽莎白菌检测方法对米尔伊丽莎白菌感染引发病害的诊断及防控措施的建立均具有重要意义。本研究以米尔伊丽莎白菌为研究对象,建立双重PCR和荧光定量PCR检测方法,以期为米尔伊丽莎白菌感染的早期检测及流行病学调查提供技术支持。1.米尔伊丽莎白菌双重PCR检测方法的建立:分别以伊丽莎白菌的PNGase F基因、米尔伊丽莎白菌的ure G基因为分子靶标,设计两对扩增片段长度为1192 bp与246 bp的特异性引物,优化反应条件,并对其特异性、灵敏性进行评价。结果显示:该双重PCR检测方法具有良好的特异性和灵敏性。PNGase F基因引物仅对伊丽莎白菌属内物种出现了特异性扩增,而ure G基因引物仅能对米尔伊丽莎白菌进行特异性扩增;能检测到的基因组DNA最低浓度为4.76×10-2ng/μL。2.米尔伊丽莎白菌荧光定量PCR检测方法的建立:基于已有的米尔伊丽莎白菌FL160902全基因组（Gen Bank:CP040516）,随机选取100个管家基因与伊丽莎白菌属各物种及常见细菌的对应基因进行同源性比较分析,以尽量保留具有较低相似度的基因为原则,得到27个候选分子靶标,用Oligo 7软件分别设计特异性引物。经PCR验证,最终筛选出mut T基因用于米尔伊丽莎白菌荧光定量PCR检测方法的建立。对5株米尔伊丽莎白菌和13株其他菌株进行特异性检测,并对检测方法的灵敏性、重复性进行评价。结果显示:该检测方法具有良好特异性,仅米尔伊丽莎白菌出现典型的S型扩增曲线,其他菌株无扩增或出现扩增曲线但Cq值大于35。该方法的标准质粒最低检测浓度为145 copies/μL,基因组DNA最低检测浓度为3.49×10-4ng/μL,比传统PCR检测方法灵敏100倍。该检测方法在3.50×103–3.50×109copies/μL内,组内变异系数在0.25–1.6%。;组间变异系数在0.48%–2.54%,具有良好重复性。3.双重PCR和荧光定量PCR检测方法的应用:采用伊丽莎白菌双重PCR方法检测了66株歪头病蛙分离株,并随机挑选部分菌株进行16S r DNA测序,用来验证双重PCR的检测结果。结果显示:66株歪头病蛙分离株中,63株特异性扩增出PNGase F和ure G基因,随机挑选的5株阳性菌株16S r DNA测序结果为米尔伊丽莎白菌,而3株阴性菌株经16S r DNA测序证实为其他物种。利用建立的荧光定量PCR检测方法和传统分离鉴定方法对来自四个有发病史养殖场的27只黑斑蛙的54份组织样品进行检测,对结果进行比较。结果显示:荧光定量PCR检测方法共检测出52份米尔伊丽莎白菌阳性组织样品,传统分离鉴定方法共检测出35份米尔伊丽莎白菌阳性组织样品,所有荧光定量PCR检测方法阴性组织样品传统分离鉴定方法检测均为阴性,无荧光定量PCR检测阴性而传统分离鉴定法检测阳性的情况。