由于木聚糖酶在动物饲料,果汁饮料生产的强酸性环境中活性和稳定性不太理想,因此找到耐酸性且活性高的木聚糖酶显得很有必要。本实验室前期将黑曲霉A25木聚糖酶xynⅢ在大肠杆菌中表达成功,其最适pH是3.8,但在酸性环境中活性不高。本研究根据G/11家族木聚糖酶最适pH二联体公式推测最适pH与YS二联体呈负相关,因此设计突变使Y后面氨基酸突变成S,期望可以降低酶的最适pH。根据黑曲霉木聚糖酶的序列找到9个Y,利用融合PCR的方法将Y后面定点突变成S,得到突变基因,按照突变位置依次命名为1号、2号、3号~9号,然后经过酶切酶连与表达载体p ET-20b连接,转入大肠杆菌BL21中表达,最终得到7号、8号、9号和3-7双突变四个位点突变成功的突变体。经证实,8号和3-7双突变酶检测不到活性,因此后续工作主要研究7号和9号和实验室已经得到的2号。将测序正确的突变菌株进行大量诱导表达,破碎细胞得到粗酶液,然后利用Co2+螯合琼脂糖凝胶亲和层析和葡聚糖凝胶纯化,最终得到纯酶。将三种突变酶与野生型酶的纯酶测定酶学性质并进行对比。结果表明:(1)2号、7号、9号三种突变酶最适pH相比野生型酶23号降低0.2个单位,与预测相符。且在2.6至3.6酸性环境中,三种突变酶比野生型酶活性都高,显示突变酶耐酸性得到提高。(2)7号突变酶的最适温度为48℃,与野生型23号相比高2℃,半衰期延长近10min,证明7号位点突变提高了酶的温度稳定性。2号和9号最适温度都是46℃,没有改变,但是半衰期降低很明显,显示这两种突变酶的温度稳定性显著降低。(3)经过酶促动力学分析表明,三种突变酶的Vmax值分别为0.013、0.030、0.025μmol/m L/min与野生型酶的0.063μmol/m L/min相比降低较为明显,说明突变酶反应速率降低。三种突变酶的Km值分别为3.14、4.02、9.38 mg/m L比野生型酶的13.56 mg/ml低,说明突变酶的底物的亲和力有所提高。而突变酶的Kcat值分别是37.60、39.40、22.05s-1相比于野生型酶的277.37降低非常明显,说明突变酶与底物的结合效率较野生型相比降低很明显。本研究以pH二联体公式为根据,用融合PCR的方法的定点突变基因,最终得到新的突变酶。从分子水平上研究木聚糖酶的耐酸性机理,证明了YS二联体可以降低木聚糖酶最适pH,为提高木聚糖酶耐酸性提供了理论依据。