目的:研究肾虚血瘀与痰瘀蕴结两组股骨头坏死的中医证型是否会对患者的塌陷速度产生明显影响以及通过分子生物学的方法结合微观生物力学特性、超微观骨细胞形态研究两种证型、不同病理区的差异,最后通过高分辨率图像建立微观有限元模型,分析骨小梁的应力特点。方法:1.收集患者基本的临床信息以及发病以来所有影像学资料。主要包括双髋关节正蛙位X线片、双侧髋关节MRI片、双侧髋关节CT片,填写内容包括患者姓名、性别、年龄、病因、初次出现髋关节疼痛的时间、视觉模拟评分表,在医师帮助下完成填写发生严重塌陷时间、JIC分型信息、中医证型,根据中医证型,将患者分为“肾虚血瘀组”与“痰瘀蕴结组”。统计“肾虚血瘀组”与“痰瘀蕴结组”两组患者的年龄、发生疼痛到确认发生严重塌陷的时间(简称“疼痛-塌陷时间”)、视觉模拟评分表结果、性别、JIC分型分布的差异。2.从手术中获取两种不同证型的股骨头坏死患者股骨头,采用MicroCT测定不同证型与病理区的骨组织压力骨小梁参数、HE染色并统计空骨陷窝率确定取材无误、OPG和RANKL作免疫组化以及蛋白印迹评估表达水平、纳米压痕测定骨标本的生物力学特性、酸蚀扫描电镜观察骨细胞形态以及骨小管数量。3.提取高分辨率MicroCT数据,结合纳米压痕的弹性模量数据,从上一章节中提取各个病变区各5个股骨头骨样本,建立骨小梁有限元模型,文件导入Abaqus6.14有限元分析软件,材料属性参照上一章节的弹性模量实验结果,建立有限元分析模型,并进行分析验证。结合扫描电镜的图像特点,评估其应力集中以及位移情况。结果:1.共收集患者共37例(40髋),肾虚血瘀组24例26髋,痰瘀蕴结组13例14髋,性别(16/8 vs 12/1,P=0.18)、侧别(9/17 vs 9/5,P=0.07)、年龄(34.0±10.8 vs 39.4±8.1,P=0.11)无明显差异,而组间VAS评分(3.2±0.9 vs 2.5±0.7,P=0.013)、疼痛-塌陷时间(5.0±1.9 vs 11.8±4.9,P<0 01)存在明显差异,同时,不同JIC分型的疼痛-塌陷时间(5.8±2.9 vs 9.3±5.5,P=0.04)存在明显差异,但在两组不同证型的组内JIC分型的构成(9/17 vs 9/5,P=0.07)则无明显差异,其中以中医证型(痰瘀蕴结和肾虚血瘀)差异最为明显,其次为两组的VAS评分差异。2.获取坏死股骨头标本共20个,其中肾虚血瘀型患者股骨头共10个,痰瘀蕴结型患者股骨头共10个。肾虚血瘀组患者平均年龄为49.4±5.5岁,其中男性4例,女性6例,痰瘀蕴结组患者平均年龄为51.6±8.4岁,其中男性8例,女性2例,两组间年龄无统计学差异(P>0.05),性别组成无统计学差异(P>0.05)。肾虚血瘀组与痰瘀蕴结组患者两组患者新鲜股骨头坏死标本基本相似。股骨头的关节表面欠光滑,软骨表面可见不同程度的磨损、脱落,股骨头塌陷,正常的球形外观消失,呈蘑菇状或不规则状。自冠状面剖开股骨头,可见软骨在不同层面厚度不一致,软骨下骨与坏死区分离,在靠近前方负重区中尤为明显,在靠近后方非负重区处仍可见坏死区与软骨下骨相连。软骨下骨可见不规则的坏死区,每层的形态各异,质地较软,部分标本可见囊性变,坏死区下方与正常骨组织连接处可见硬化带,质地较硬,外观致密,色暗。Micro-CT数据示:BV/TV:三个不同病理区结果存在明显差异(F=88.97,P<0.01),其中坏死区较正常区明显降低(27.5±6.1 vs 53.7±7.2,P<0.05),硬化区较正常区明显降低(76.4±7.8 vs 53.7±7.2,P<0.05),其中肾虚血瘀与痰瘀蕴结组间坏死区、硬化区BV/TV存在明显差异(22.6±4.8 vs 35.3±4.2,P<0.05,71.9±7.6 vs 78.9±6.2,P=0.02),两组间正常区无明显差异;Tb.N(mm):三个不同病理区结果存在明显差异(F=92.27,P<0.01),其中坏死区较硬化区明显降低(0.93±0.12 vs 3.45±0.42,P<0.05),硬化区较正常区明显上升(3.45±0.42 vs 1.96±0.24,P<0.05),其中肾虚血瘀与痰瘀蕴结组间坏死区、硬化区Tb.N存在明显差异(0.79±0.10 vs 1.18±0.12,P<0.05,3.15±0.37 vs 3.50±0.44,P<0.01),两组间正常区无明显差异;Tb.Sp(μm):三个不同病理区结果存在明显差异(F=84.96,P<0.01),其中坏死区较硬化区和正常区都明显上升(1431.7±348.4 vs 353.7±41.2,P<0.05;1431.7±348.4 vs 531.1±38.7,P<0.05),其中肾虚血瘀与痰瘀蕴结组间坏死区Tb.SP存在明显差异(1586.2±290.3 vs 1277.2±344.9,P<0 05),两组间硬化区、正常区无明显差异;Tb.Th(μ m):三个不同病理区结果存在明显差异(F=87.70,P<0.01),其中坏死区较硬化区明显降低(133.9±23.7 vs 299.1±28.5,P<0.05),硬化区较正常区明显上升(299.1±28.5 vs 183.0±23.7,P<0.05),其中肾虚血瘀与痰瘀蕴结组间坏死区、硬化区Tb.Th存在明显差异(115.6±20.3 vs 150.3±23.3,P<0.05,288.2±29.1 vs 312±25.2,P=0.03),两组间正常区无明显差异两组股骨头。不同病理区的HE染色结果显示,空骨陷窝率在不同病理区中呈现明显差异(F=92.27,P<0.01)。其中两组的坏死区空骨陷窝率都较硬化区与正常区明显上升(肾虚血瘀:0.81±0.07 vs 0.26±0.06,P<0.05,0.81±0.07 vs 0.28±0.09,P<0.05;痰瘀蕴结:0.84±0.05 vs 0.23±0.11,P<0.05,0.84±0.05 vs 0.18±0.07,P<0.05)。两组间相同病理区之间的空骨陷窝率无明显差异。OPG、RANKL蛋白印迹:RANKL:两组标本在坏死区均呈现高表达,痰瘀蕴结组内硬化区表达量较正常区下调(P<0.05);组间差异方面,肾虚血瘀组在硬化区RANKL的表达量较痰瘀蕴结组明显上调(P<0 05),在组间在坏死区、正常区之间的表达量均无明显差异。OPG:肾虚血瘀组内坏死区OPG的表达量较同组的硬化区和正常区下降(P<0.05);痰瘀蕴结组硬化区OPG的表达量较同组的坏死区区和正常区上升(P<0.05);组间差异方面,两组股骨头标本之间的坏死区、硬化区OPG表达量均有明显差异,在两个病理区中,痰瘀蕴结组均比肾虚血瘀组上调(P<0.05)。纳米压痕结果显示:弹性模量:硬化区弹性模量较坏死区和正常区明显上升(22.6±2.1 vs 16.7±2.1,P<0.05,22.6±2.1 vs 18.5±1.9,P<0.05),坏死区较正常区明显下降(16.7±2.1vs18.5±1.9,P<0 05),肾虚血瘀组的坏死区较痰瘀蕴结组弹性模量明显下降(15.6±2.0 vs 17.7±1.7,P=0.02),两组的硬化区和正常区无明显差异。硬度:硬化区硬度较坏死区和正常区明显上升(0.98±0.18 vs 0.70±0.15,P<0.05,0.98±0.18 vs 0.84±0.14,P=0.05),坏死区较正常区明显下降(0.70±0.15vs 0.84±0.14,P<0.05),两组间的坏死区、硬化区和正常区的硬度无明显差异。扫描电镜在细胞计数方面,硬化区细胞计数较坏死区和正常区明显上升(50.8±9.3 vs 9.1±4.9,P<0.05;50.8±9.3 vs 35.2±4.6,P<0.05),坏死区较正常区明显下降(9.1±4.9 vs 35.2±4.6,P<0.05),两组间的坏死区、硬化区和正常区的细胞计数无明显差异;骨小管计数:硬化区骨小管计数较坏死区和正常区明显上升(28.2±6.7 vs 14.4±3.4,P<0.05;24.2±2.9 vs 14.4±3.4,P<0.05),坏死区较正常区明显下降(14.4±3.4 vs 24.2±2.9,P<0.05)两组间的坏死区、硬化区和正常区的骨小管计数无明显差异。3.有限元分析结果:组内比较方面,肾虚血瘀组内坏死区内最大应力值较硬化区明显升高(16.67±5.89 vs 9.51 ± 1.66,P<0 01;16.67±5.89 vs 9.25±1.45,P<0.01),硬化区与正常区无明显不同(9.51 ± 1.66 vs 9.25± 1.45,P=0.91);坏死区最大位移较硬化区明显升高(17.56±4.09 vs 2.47±1.64,P<0.01;17.56±4.09 vs 1.40±0.43,P<0.01),硬化区与正常区无明显不同(2.47±1.64 vs 1.40±0.43,P=0.51);痰瘀蕴结组内坏死区内最大应力值较硬化区明显升高(18.76±2.08 vs 8.79±1.71,P<0.001;18.76±2.08 vs 8.30±1.42,P<0.01),硬化区与正常区无明显不同(8.79±1.71 vs 8.30±1.42,P=0.69);坏死区最大位移较硬化区明显升高(8.18±3.61 vs 1.30±0.78,P<0.01;8.18±3.61 vs 1.10±0.42,P<0.01),硬化区与正常区无明显不同(1.30±0.78 vs 1.10±0.42,P=0.88);组间差异方面,肾虚血瘀组的坏死区最大位移较痰瘀蕴结组坏死区上升(17.56±4.09 vs 8.18±3.61,P<0.05)。由应力云图可见,坏死区的骨小梁明显较坏死区和正常区稀疏,骨小梁数量较少,小梁之间存在大量圆孔状、斑片状孔洞或间隙,骨小梁厚度下降且明显变薄,骨小梁之间间隙明显增宽。当加载载荷时,应力在骨小梁内部传导时经过较细的小梁结构时应力明显上升,反映在最大应力值一般处在骨小梁结构变细处。由应力云图可见,硬化区骨小梁较坏死区增加,骨小梁之间间隙变小。骨小梁内部仍存在一定量圆孔状、斑片状孔洞或间隙,骨小梁厚度较坏死区明显上升且变厚,但骨小梁之间排列较混乱。同样,当加载载荷时,正常区因为骨小梁数量较多、互相之间连接增多和骨小梁厚度理想,提示受到相同提应力时骨小梁的形变较坏死区明显改善。在1kX放大倍率坏死区的SEM图像中,可以在骨小梁的中找到裂缝,这些裂缝多集中于骨小梁夹角较大的地方,可能是骨小梁应力集中,进而产生崩裂的表现。结论:在ONFH发生疼痛到影像学发生严重塌陷的病例中,疼痛作为塌陷的外在表现,可较客观反映股骨头头内不稳的状态,而中医疾病辩证分型和JIC分型都会明显加快病情发展的速度,使ONFH在短期内发展成股骨头塌陷的状态。通过Micro-CT扫描、OPG和RANKL的免疫组化与蛋白印迹、纳米压痕测试和酸蚀扫描电镜的结果,基本可以反映两组的坏死区、硬化区存在不同的骨代谢微环境。在肾虚血瘀组的坏死区中,Micro-CT与纳米压痕的结果联合显示该病理区的骨小梁无论在数量还是质量方面都较同组或痰瘀蕴结组的坏死区下降,这种原因可能与激素的作用、RANKL的高表达、OPG的低表达和坏死区缺少骨细胞感应机械刺激有关,其病理特点是以骨吸收增强的溶骨性骨质破坏为主;在痰瘀蕴结组的坏死区中,骨小梁的数量与质量趋势与肾虚血瘀组相似,都较硬化区和正常区下降,但无论在骨小梁的数量和质量、OPG表达都较肾虚血瘀组上升,该病理区的微环境可能具有较肾虚血瘀组较高成骨能力,稳定性可能优于肾虚血瘀组;二者的差异可能是肾虚血瘀组患者较痰瘀蕴结组患者更快发生股骨头塌陷的原因之一。而两者的硬化区虽然在OPG和RANKL表达和Micro-CT数量上存在差异,但两者硬化区的骨小梁数量和质量均比坏死区和正常区理想,该结果的原因是硬化区的应力重分布现象可能是促成该处骨修复的主要原因,力学刺激在具备正常的血运环境中通过多种途径实现骨修复与骨再生。股骨头坏死的坏死区头内不稳,甚至坏死股骨头的塌陷很可能是骨小梁结构与弹性模量改变的共同结果,坏死区的骨小梁在力的作用下产生应力集中、严重形变,最终导致骨小梁的断裂、压缩等现象,长时间大量骨小梁的失效严重影响股骨头的力学稳定性,最终导致股骨头的塌陷;硬化带作为坏死骨修复的重要起点,修复的骨小梁其弹性模量与骨小梁结构都与正常骨小梁有明显区别,但其对力学加载的耐受以及在受力的条件下较小的形变可以在股骨头修复的过程中提供修复骨的力学稳定。通过“临床观察—实验室微观研究—基于骨小梁的有限元研究证据链”,从分子生物学、生物力学、计算机模拟多维度揭示了不同证型股骨头内部不同病理区骨小梁的骨微环境,部分解答了股骨头塌陷的原因,提示了在临床工作中,应该高度重视坏死范围较大的肾虚血瘀型ONFH患者可能会在短时间内发生严重塌陷,容易错过最佳治疗时机,而造成这种现象的原因可能是坏死区的内部骨小梁的结构和力学特性都发生了下降,导致严重的头内不稳状态,而硬化区的骨修复可能建立在局部力学刺激的基础上完成。