NR2F2调控对血管内皮细胞的影响及其与膀胱癌联系的研究

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目的肿瘤的生成与生长和血管有着不可分割的关系。而目前已发现核受体亚家族 2F 组成员 2(nuclear receptor subfamily 2 group F member 2,NR2F2)与前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌症的发生与进展有关,并在胰腺癌、乳腺癌等多种动物模型当中表现出促进肿瘤中血管的生成。但在膀胱癌中的研究甚少。因此,该研究希望发现膀胱癌与NR2F2的关系,并从基因层面上分析 NR2F2 与血管内皮细胞(human vascular endothelial cells,HVEC)的关系,希望能为膀胱癌的诊治提供新路径、新指标和新研究方向。方法(1)将培育过膀胱正常细胞与几组膀胱癌细胞的上清溶液分别去培养了HVEC,运用蛋白质免疫印迹方法(Western Blot)检测各组NR2F2蛋白表达情况。(2)构建含有NR2F2基因的重组质粒载体pLVX-IRES-Neo,克隆出过表达的质粒载体。(3)通过siRNA干扰,构建出敲低NR2F2基因的细胞系模型,转染人肺静脉内皮细胞(MVES),应用实时荧光定量(RT-qPCR)与WB检测转染后MVES的NR2F2的mRNA表达变化及细胞培养上清液的NR2F2的分泌情况,进一步鉴定转染效果。(4)NR2F2过表达质粒和NR2F2 siRNA分别转染血管内皮细胞,Western Blot检测以上2组和正常组(NC)的蛋白水平情况,各组进行细胞增殖检测(CCK8)、迁移检测(Transwell)、血管形成实验等细胞功能检测。结果(1)3组膀胱癌细胞株的上清液培养的HVEC比正常膀胱细胞上清液中HVEC的NR2F2在蛋白水平有着更高的表达。(2)基因NR2F2成功克隆至载体(pLVX-IRES-Neo Vector)中,与NCBI上已知NR2F2序列进行BLAST分析,提示成功克隆。(3)成功筛选出干扰效果最佳的siRNA为NR2F273。(4)NR2F2过表达组产生的NR2F2蛋白比NR2F2 siRNA组明显增加(P<0.05)。在细胞功能实验上,NR2F2过表达组比NR2F2 siRNA组细胞增殖能力更强、细胞迁移能力更强、血管形成更加丰富等。结论(1)NR2F2能够促进血管内皮细胞的增殖。(2)实验成功构建含有NR2F2基因的质粒载体pLVX-IRES-Neo,并筛选出有效干扰NR2F2基因表达的NR2F2-siRNA引物。(3)根据细胞功能实验表明NR2F2能够促进血管内皮细胞的增殖,结合膀胱共培养检测结果提示NR2F2可能促进膀胱癌HVEC来促使其发展。
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