穗部性状的正常发育与产量有密切关系,因此发掘控制穗部性状发育的基因,对解析调控穗部性状的遗传网络有重要作用。本研究中,以EMS诱导籼稻保持系骨干亲本宜香1B,获得一份长护颖突变体(long sterile lemma 59)和一份穗扭突变体(panicle twisted 63),分别命名为lsl59、pt63,突变体经过多代自交后,能够稳定遗传。利用突变体与粳稻品种02428、宜香1B杂交,建立F2遗传分离群体,再结合SSR分子标记及Mutmap技术对突变性状进行遗传分析和基因定位。一、lsl59研究结果如下:1.通过农艺性状观察发现,突变体lsl59的株高、千粒重和结实率在一定程度上有所下降,而护颖显著伸长。2.电镜扫描发现,与野生型不同,lsl59小穗上的长护颖表皮并不光滑,而是有序排列的突起状结构,与正常内外稃表面相似,这表明长护颖可能具有内外稃相似的特性。qRT-PCR分析颖壳(内外稃)、外稃及内稃标记基因发现,在突变体lsl59的异常增长的护颖中,颖壳标记基因表达增加,内稃标记基因几乎没表达,而外稃标记基因表达也增加,这进一步表明长护颖可能具有外稃的特性。3.利用扫描电镜对孕穗期护颖的发育进行观察,发现lsl59护颖的伸长出现在小穗发育的SP7时期。体式显微镜对不同长度的小穗观察,发现随着幼穗的生长lsl59护颖也在随之生长,最后直至成熟。总之,LSL59基因影响护颖的生长和伸长,但并不影响花器官的发育。4.遗传分析表明lsl59的突变性状是由单隐性核基因调控。通过基因定位将候选基因定位在12号染色体Indel标记LYX-205和LYX-216之间;通过Mutmap重测序的方法,在定位区间内发现2个Index值都为1的基因。使用dCAPS标记进行共分离分析,发现Os12g0161700基因与突变表型完全分离。通过测序发现,突变位点在CDS区第307位碱基,由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),导致103位脯氨酸(Pro)变为丝氨酸(Ser)。因此,将候选基因确定为Os12g0161700。最后利用CRISPR/CAS9技术在野生型背景下对该基因进行敲除,获得的转基因株系表现出护颖伸长的性状,因此说明Os12g0161700就是调控突变体lsl59突变表型的基因。目前水稻中还没有关于该基因的报道,因此将其命名为LSL59(Long sterile lemma59)。5.LSL59基因在各个器官都有一定的表达,属于组成型表达。其在内外稃及幼穗中表达量最高,在雌蕊中也有较高的表达,但在分化发育的穗中呈现出较低水平的表达。6.分析其他水稻护颖发育相关基因的表达,发现在lsl59中OsMADS34显著下调,FZP和G1显著上调,而LF1则无明显变化。这些结果表明,lsl59突变体中护颖发育可能与相关基因的转录水平变化有关。总之,目前水稻中还没有关于LSL59基因调控护颖发育的报道,因此,该基因为花器官发育机制的研究奠定了基础。二、pt63研究结果如下:1.农艺性状观察发现,突变体pt63植株与野生型植株相比最大差别是穗部枝梗呈无规则弯曲,且结实率下降约70%,千粒重下降约10%,从而导致低产。2.通过激素测定发现,突变体pt63和野生型穗部在未发生卷曲之前IAA含量及ABA含量基本相同,但穗部发生扭曲后IAA含量比野生型极显著增加,而ABA的含量减少。推测可能由于内源IAA含量过高,导致组织器官在发育时细胞生长不均,形成扭曲性状。3.遗传分析表明pt63的突变性状是由单隐性核基因调控。通过基因定位将目的基因定位在3号染色体InDel3-2和InDel3-3之间,物理距离36.899kb;其中有6个注释基因,对这6个基因及其启动子测序,只发现LOC_Os03g24910基因在ATG上游66bp处由G变为A,该基因功能注释为结瘤相关蛋白。因此将LOC_Os03g24910作为影响穗扭曲的候选基因进行后续研究,转基因功能验证正在进行中。