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水稻（Oryza sativa）作为世界上最重要的粮食作物之一,全世界超过50%的人口以之为主食,因此不断提高水稻的产量意义重大。杂交水稻的推广,为人类粮食的增产做出了巨大贡献。在水稻雄性生殖发育过程中,花药和花粉的发育扮演着十分重要的角色,而花粉壁对花粉而言具有特殊作用,一方面可以保护雄配子免受各种环境胁迫和病原体攻击,另外也具有促进花粉萌发的功能。因此,正常的花粉壁建成是功能花粉形成所必需的。近年来,水稻花粉发育机制取得了大量进展,但相比拟南芥仍存在一定差距。雄性不育突变体是研究花粉发育的材料基础。因此,为了增进对水稻花粉发育的了解,本实验通过筛选EMS诱导的籼稻品种9311突变体库,获得了一份新的雄性不育突变体材料。通过遗传学、分子生物学和细胞学等实验手段,成功克隆了该雄性育性控制基因,并初步验证了其功能。主要结果如下:1.突变体鉴定。与野生型9311相比,突变体表现正常的营养生长、花序和花形态,但突变体花药更小且颜色更浅。I2-KI染色液进一步染色发现突变体花粉粒变少、变形、皱缩,且基本不着色。据此,将突变体命名为lsp2（Less and shrunken pollen 2）。遗传分析显示该突变性状受一对隐性基因控制。2.细胞学鉴定。花药半薄切片结果显示,突变体在花药发育的第8期开始出现缺陷,表现为绒毡层细胞肿胀,降解紊乱;进一步扫描电镜和透射电镜观察发现,突变体花药绒毡层中的乌氏体发育异常,花粉外壁异常。3.基因定位。通过构建突变体基因组混池并利用MutMap技术筛选与不育表型关联的SNP,我们发现2号染色体上一个SNP（G变成A）位点与突变性状紧密连锁,这个SNP位点位于预测基因的第四个外显子上。进一步共分离实验证实该SNP所在基因为目标性状的候选基因。4.候选基因功能验证。利用CRISPR/Cas9对该候选基因进行编辑,发现所有功能缺失的突变体（日本晴背景）都表现为雄性不育,且与突变体lsp2的不育缺陷基本一致。进一步回交构建分离群体,共分离分析证实该基因就是LSP2,表明LSP2是控制水稻雄性育性关键基因。5.组织表达模式分析。定量PCR和GUS组织化学染色实验结果共同显示,LSP2在根、幼穗和花药中高表达,在雌蕊、茎、叶和内外稃中几乎不表达;进一步花药切片证实LSP2主要在绒毡层中特异表达。6.亚细胞定位。通过烟草瞬时表达实验,发现LSP2可能定位在膜上。进一步将2×35S::LSP2::GFP载体质粒与膜标记br356通过农杆菌介导渗入在烟草（Nicotiana benthamiana）叶表皮细胞中单独表达或共表达,发现LSP2主要定位在细胞膜上。7.相关基因表达差异。定量PCR结果显示,在lsp2中,OsPKS2和TDR的表达无显著变化,但CYP704B2、DPW、OsACOS12和OsNP1的表达水平显著低于野生型,表明LSP2控制花粉发育的生化途径可能与CYP704B2、DPW、OsACOS12和OsNP1具有相关性。