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补体系统的异常过度活化是缺血再灌注损伤、异种器官移植急性排斥反应等许多炎症性疾病的发生利发展的重要始动因素之一。血清补体抑制水平的降低会导致溶尿综合症、阵发性睡眠性血红蛋白尿、肾小球肾炎及遗传性血管源性水肿等疾病的发生。抑制补体的过度活化是治疗这些疾病的一个新的思路。补体活化有经典、旁路和甘露糖结合凝集素(MBL)三条途径，但这三条途径都在C3处汇合。补体1型受体( complement receptor type1，CRl)能够结合C3b和C4b，具有加速C3/C5转化酶裂解的加速衰变活性( decay-accelerating activity DAA)和辅助I因子裂解C3b和C4b的辅助因子活性(co-factor activity CA)。由于CR1是一个多能有效的补体抑制剂，因此在CR1基础上研制补体抑制剂是一个十分合理的策略。
由于CR1中的内在同源性，在除羧基端2个SCRs外的28个SCRs形成4个大的长同源重复(long homology repeat LHR)，每个由7个SCRs组成。分别称为LHRA、LHR B、LHR C和LHR D。其中，LHRA中的前3个SCRs组成有功能性位点I，而LHR B和LHRC中的前3个SCRs组成的位点只有三个氨基酸的不同，有相同的功能，都称为功能性位点II。
位点I能够结合C4b，而结合C3b的能力非常微弱，对C3转化酶有很高的加速衰变活性，但辅助I因子裂解C3b和C4b的能力比较弱。位点II能够有效地结合C3b和C4b，结合C4b的能力比结合C3b的能力弱。位点II对于C3b和C4b有很高的CA活性，但对C3转化酶的DAA活性比较低，因此可以说一拷贝的加速衰变因子( decay-accelerating factor DAF)样位点和2个拷贝的膜辅助蛋白(membrane cofactorprotein MCP； CD46)样位点使CR1成为补体活化调节剂(regulators of complementactivation RCA)家族中唯一的能够失活裂解全部4种C3和C5转化酶的多功能性分子。
试验表明，尽管LHR A对C3转化酶有足够的DAA活性，但对于C5转化酶的DAA活性较低，要使LHRA对C5转化酶具有较好的DAA活性，其后必须跟包含有位点II的LHR B或LHR C。LHR B或LHR C的作用是结合三聚体的C5转化酶中的C3b。
本研究从CR1分子的结构和功能出发，利用重叠延伸PCR(splicing overlapextention PCR，SOE-PCR)的方法构建出能够结合C3b和C4b的双功能域CR1衍生物，并在原核系统中进行表达并验证了其活性，为新型补体抑制剂的进一步研制奠定基础。研究取得了以下主要结果：
1.从人外周血单个核细胞中提取总RNA，经RT-PCR成功地克隆了编码人补体受体I型胞外区CRl-SCRl-3的cDNA(其长度为585bp)，连接于pMD18-T simple载体后测序，序列比对发现与GenBank上登录的编码相应补体受体I型cDNA区域序列一致。
2.以构建的含功能性片段I的T载体为模板，扩增出平端的功能性位点I；以本室构建的pET32a-CRl-SCR15-18为模板扩增出平端的功能性片段II( CRl-SCR15-17)；利用重叠延伸PCR方法扩增出包含双功能域的融合基因。将融合基因重组于pET32a(+)载体，成功地构建了双功能域的重组原核表达质粒，命名为pET32- CR1-2D。氨苄青霉素筛选出阳性重组质粒经酶切及序列测定确认。
3.将构建的pET32-CR1-2D载体成功转入大肠杆菌Rosetta(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析发现在分子量约63kDa处出现一条明显表达条带；其以包涵体形式表达；并确立pET32- CR1-2D在37℃条件下，1mmol/L IPTG诱导4h时，大肠杆菌中有较高的蛋白表达水平。采用抗6xHis抗体经Western blot进一步证实了此蛋白。
4.蛋白经Ni-NTA柱纯化后，可得到单一条带的蛋白，表明采用亲和层析可实现Txr-CRl-2D蛋白的一步纯化。透析复性试验发现尿素浓度梯度逐步递减复性效果较好，最佳复性条件为：透析液中谷胱甘肽氧化型为1.5 mmol/L、还原型为3,5 mmol/L时析出蛋白较少，且补体溶血抑制实验表明此时生物活性较好；透析复性后的蛋白经肠激酶酶切，及随后Ni-NTA纯化后，可获得不含外源氨基酸的重组CRl-2D蛋白。
5.体外功能试验验证了重组蛋白的活性。体外免疫介导红细胞溶解试验模型中，分光光度计方法测定上清中血红蛋白发现该蛋白能够抑制红细胞溶解；流式细胞术的方法发现重组蛋白能够减少红细胞表面C3b沉积；ELISA方法发现重组蛋白能够减轻上清中C5a产生。这些指标一定程度上说明了CRl-2D有抑制血管内溶血和血管外溶血的能力。在小鼠体内建立免疫介导红细胞溶解模型，流式细胞术的方法观察了输注红细胞在不同时相点存活情况。证实了该重组蛋白在标记红细胞输注的两小时内能够延长红细胞的存活时间。
综上所述：本实验成功的构建了由位于LHR A内的功能性片段I和位于LHR C内的功能性片段II组成的双功能域的重组CR1分子，体内外功能试验验证了其生物学活性。我们的试验结果表明该重组双功能域蛋白研制开发新型补体抑制剂奠定了良好的基础。