亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease, HD)是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病。临床上,HD患者主要表现为运动障碍、认知和精神异常。病理学上,早期以大脑皮质深层神经元和纹状体中投射神经元的选择性丢失为特征,晚期也出现下丘脑、海马等脑区的明显变性。HD由HD基因突变所致,HD基因编码亨廷顿蛋白(huntingtin, Htt).由于突变的HD基因表达产物突变Htt的致病机制不清,目前尚无有效治疗HD的方法。许多研究表明,HD早期症状的出现与突触功能的异常有关。突变Htt对突触功能具有明显的毒性：突变Htt在神经元轴突终末内形成聚集物,使突触小泡数量减少、结构紊乱；突变Htt抑制突触小泡摄取和释放神经递质,增加神经元对NMDA受体激动剂的敏感性。突触小泡是突触前成份中的一种重要细胞器,通过运载和调节神经递质的释放在突触传递中起重要作用。突触小泡的功能受到多种突触蛋白的调节。突变Htt能影响多种突触蛋白的表达和/或翻译后修饰,也能与突触蛋白发生异常互作。突触小泡蛋白2(Synaptic vesicle protein2, SV2)是神经元突触小泡和内分泌细胞分泌颗粒上的一种跨膜糖蛋白,具有SV2A.SV2B和SV2C三个亚型,其中SV2C主要局限分布在纹状体、苍白球、黑质、中脑、嗅球等旧脑区和海马的CA3和齿状回区,在神经递质释放和突触传递中起重要作用。SV2C在纹状体、苍白球、黑质、海马等HD受累区域的局限性表达提示,突变Htt对SV2C的表达和／或翻译后修饰的影响或与其发生异常相互作可能与HD的发生有关。但突变Htt与SV2C的关系尚不清楚,突变Htt是否影响SV2C的表达和／或翻译后修饰,目前未见报道。生物信息学分析显示,SV2C的启动子上含有能与阻遏子元件沉默转录因子(repressor element silencing transcription factor, REST)结合的序列神经元限制性沉默元件(neuron restrictive silencer element, NRSE)。REST与NRSE的结合对基因的表达具有阻遏作用。大量研究表明,突变Htt能与多种转录因子结合而影响基因的转录。正常Htt能与REST结合使其定位在细胞质内,对NRSE控制的基因起正性调控作用,而突变Htt则使REST发生核转位,使受NRSE控制的基因表达被抑制。REST作为一种转录抑制因子是否调控SV2C的表达,突变Htt是否通过与REST的作用影响SV2C的表达,目前均未见报道。本研究在观察突变Htt是否影响SV2C表达的基础上,比较了不同REST表达水平对SV2C表达的影响,分析了REST是否通过与SV2C启动子结合来调控SV2C的转录,检测了突变Htt对SV2C启动子活性的影响,并对突变Htt是否促进REST的核转位进行了进一步观察。1.突变Htt下调SV2C的表达为了明确突变Htt是否影响SV2C的表达,首先利用免疫印迹和RT-PCR技术对HD转基因小鼠脑内和HD细胞模型中SV2C蛋白和mRNA进行检测。在表达Htt氨基末端171个氨基酸且含82个谷氨酰胺重复序列的HD转基因小鼠(TG小鼠)的大脑海马、纹状体和皮质中,SV2C蛋白和mRNA水平在第14w即明显降低,第18 W和第20 w进一步降低。免疫组织化学检测也发现,TG小鼠上述脑区的SV2C免疫反应性也呈进行性减弱。在表达含150个CAG重复序列的Htt基因第一外显子的HD转基因小鼠(R6/2小鼠)中,也观察到类似变化。在转染表达含150个CAG重复序列的Htt基因第一外显子的N2a细胞中,SV2C蛋白和mRNA水平在转染48h、72h和96 h均呈进行性下降。以上结果表明,突变Htt可下调SV2C的表达。2. REST通过与SV2C的启动子结合抑制SV2C转录为了明确SV2C的表达是否受REST的调控,首先观察了不同REST表达水平对SV2C的影响。免疫印迹和RT-PCR检测显示,在N2a细胞过表达REST使SV2C的蛋白和mRNA水平明显下调,而沉默REST后,SV2C的蛋白和mRNA水平则明显上调。进而用染色质免疫共沉淀(Chromatin Imunoprecipitation, ChIP)技术检测出具有NRSE基序的SV2C启动子区(-105,-83bp)片段能与REST结合,随后用PCR方法在SV2C的5’侧翼区扩增出SV2C(-322,+3bp)、SV2C(-105,+3bp)、SV2C(-83, +3bp) 3个不同大小的片段,并克隆成不同的pGL3-basic荧光素酶报告基因质粒后,通过双荧光素酶报告基因检测发现,过表达REST后含SV2C(-322,+3bp)和SV2C(-105,+3bp)报告基因的荧光素酶活性明显减弱,而含SV2C(-83,+3bp)的报告基因的荧光素酶活性没有减弱,由此提示SV2C启动子区(-105,-83bp)是REST调节SV2C转录所必须的。这些结果提示REST可与SV2C启动子上的NRSE基序结合来抑制SV2C的转录。3.突变Htt通过促进REST核转位抑制SV2C基因的转录为了证明突变Htt是否可以抑制SV2C启动子的活性,将表达正常Htt的质粒和表达突变Htt的质粒分别与SV2C启动子中的(-322,+3bp)片段克隆成的pGL3-basic荧光素酶报告基因质粒共转染N2a细胞后发现,共转染表达突变Htt的质粒后荧光素酶活性较共转染表达正常Htt的质粒的荧光素酶活性比较明显减弱,并呈浓度依赖性,而沉默REST后,共转染表达突变Htt的质粒后荧光素酶活性无明显变化,由此表明突变Htt可通过REST抑制SV2C基因的转录。ChIP实验发现,与转染表达正常Htt的细胞比较,转染表达突变Htt的N2a细胞中REST与SV2C启动子的结合明显增强。在TG小鼠、R6/2小鼠脑组织中和表达突变Htt的N2a细胞中,RT-PCR检测显示,REST的mRNA水平无明显变化,免疫印迹检测表明REST,总蛋白水平也无明显改变,但核内REST蛋白水平显著增加。对TG小鼠、R6/2小鼠脑组织和表达突变Htt的N2a细胞进行免疫组织化学检测进一步证实,REST在细胞核内定位增多。因此,突变Htt不影响REST的表达但可以促进其从细胞质到细胞核的转位。以上结果表明,突变Htt可通过促进REST从细胞质到细胞核的转位而增强REST与SV2C启动子中NRSE的结合,进而抑制SV2C基因的转录和表达。由此提示,HD中选择性病理学变化可能与SV2C表达的减少而使突触小泡释放神经递质和突触传递功能障碍有关,SV2C基因的转录调控可作为探索治疗HD方法的靶点。