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目的:探讨培养、纯化小胶质细胞的方法,建立一种简单且效率较高的原代小胶质细胞体外分离及纯化方法。方法:以经典McCarthy的小胶质培养方法为基础,用梯度离心法分离纯化小胶质细胞,流式细胞仪对所分离的小胶质细胞并进行鉴定。结果:分离、培养的小胶质细胞,折光性强,类圆形,有毛刺样细胞突起。流式细胞仪检测所分离的细胞中CD11b(+)MCH II(-)细胞含量在95%以上。结论:本实验方法所培养的小胶质细胞纯度高,为其功能研究奠定了基础。目的:研究G-CSF对Hb激活的小胶质细胞致炎作用的调节及其可能的调节机制。方法:取原代大鼠小胶质细胞(见实验第一部分)加入72孔板,调整细胞数为0.5×10~5/孔,MEM完全培养基培养。将小胶质细胞分为3组,对照组、Hb组和G-CSF组,每组24孔。Hb组中加入大鼠血红蛋白1 ul,G-CSF组在Hb组的基础上加入rhG-CSF至终浓度10ng/mL,对照组中不加入Hb及G-CSF,仅加入等量生理盐水。分别于2 h、6 h、12 h、24 h取3组各5孔小胶质细胞进行检测。ELISA测定3组上清液中IL-1、TNF-α的含量,QRT-PCR测定3组小胶质细胞中IL-1及TNF-αmRNA的表达,western blot法半定量检测12 h时3组小胶质细胞中p-JNK和p-p38MAPK的含量。结果:Hb组和G-CSF组上清液中IL-1及TNF-α含量各时间段均高于对照组;Hb组和G-CSF组上清液中IL-1于2 h时开始升高,6h时达到顶峰,12 h时开始下降,G-CSF组IL-1在6h和12 h时低于Hb组,并有统计学差异(p<0.05);Hb组和G-CSF组上清液中TNF-α于2 h时开始升高,12 h时达到顶峰,24h时开始下降,G-CSF组TNF-α在6 h和12 h时低于Hb组,并有统计学差异(p<0.05),24h显著低于Hb组(p<0.01)。Hb组和G-CSF组小胶质细胞中IL-1及TNF-αmRNA水平各时间段均高于对照组;Hb组和G-CSF组上清液中IL-1 mRNA于2 h时开始最高,6h时开始下降,24 h时最低,G-CSF组IL-1 mRNA在6h和12 h时低于Hb组,并有统计学差异(p<0.05);Hb组和G-CSF组小胶质细胞中TNF-αmRNA于2 h时开始升高,6 h时达到顶峰,12 h时开始下降,G-CSF组TNF-αmRNA在6 h和12 h时低于Hb组,并有统计学差异(p<0.05),24 h显著低于Hb组(p<0.01)。12 h时3组小胶质细胞中均有p-JNK和p-p38MAPK表达;与对照组相比,Hb组小胶质细胞中p-JNK和p-p38MAPK均显著升高(p<0.01);G-CSF组小胶质细胞中p-JNK和p-p38MAPK明显低于Hb组(p<0.05),但高于对照组(p<0.05)。结论:Hb能够通过刺激小胶质细胞中IL-1、TNF-αmRNA合成以及表达而导致其炎症反应。G-CSF能够通过降低Hb激活的小胶质细胞合成以及释放的炎性因子IL-1和TNF-α从而抑制小胶质细胞的致炎作用,G-CSF这种抗炎作用可能通过抑制JNK和p38MAPK磷酸化这一途径实现。目的:研究G-CSF对激活小胶质细胞吞噬血红蛋白能力的影响及其作用机制。方法:取原代大鼠小胶质细胞加入72孔板,调整细胞数为0.5×10~5/孔,MEM完全培养基培养。将小胶质细胞分为3组,对照组、Hb组和G-CSF组,每组24孔。Hb组中加入大鼠血红蛋白1 ul,G-CSF组在Hb组的基础上加入rhG-CSF至终浓度10ng/mL,对照组中不加入Hb及G-CSF,仅加入等量生理盐水。分别于2 h、6 h、12 h和24 h取3组各6孔小胶质细胞进行检测。氰化高铁法测定3组上清液中Hb的含量,QRT-PCR测定3组小胶质细胞中CD163/HO-1 mRNA的表达,免疫荧光染色检测CD163蛋白在小胶质细胞膜上的表达,western blot测定3组HO-1的含量。结果:Hb组和G-CSF组小胶质细胞上清液中Hb含量随时间变化逐渐降低; G-CSF组上清液中Hb含量在6 h时低于对照组(p<0.05),在12 h、24 h时显著低于对照组(p<0.01)。QRT-PCR测定CD163 mRNA发现,在各组小胶质细胞中均可见CD163 mRNA表达,其中对照组各时间段CD163 mRNA水平无明显变化;加入Hb后,Hb组小胶质细胞中CD163 mRNA水平随时间改变无明显变化,与对照组相比,各时间段CD163 mRNA水平无明显差异(p>0.05);加入Hb后,随时间改变,G-CSF组小胶质细胞中CD163 mRNA水平逐渐升高,12 h时达到顶峰,24 h时下降,且G-CSF组CD163 mRNA水平在6 h、12 h和24 h时均高于Hb组,以12 h时最为显著(p<0.01)。QRT-PCR测定HO-1 mRNA发现,对照组mRNA随时间变化无明显改变;Hb组HO-1 mRNA水平随时间变化逐渐升高,并于24 h达到最高峰,与对照组相比,各时间段HO-1 mRNA水平均增高(p<0.05);加入Hb后,随时间改变,G-CSF组小胶质细胞中HO-1 mRNA水平逐渐升高,24 h时达到顶峰,且G-CSF组HO-1 mRNA水平在各时间段均高于Hb组(p<0.05)。western blot测定3组HO-1含量发现,3组小胶质细胞内均有HO-1表达;对照组中HO-1表达水平较低,各时间点无变化;Hb组HO-1水平随时间变化逐渐升高,于24 h达到最高峰,与对照组相比,各时间段HO-1水平均增高(p<0.05);随时间改变,G-CSF组小胶质细胞中HO-1水平逐渐升高,24 h时达到顶峰,且G-CSF组HO-1水平在各时间段均高于Hb组(p<0.05)。结论:生理状态下的小胶质细胞不表达CD163蛋白,低表达HO-1蛋白;经Hb刺激后激活的小胶质细胞CD163 mRNA水平与激活前相比无明显变化,但CD163蛋白高于激活前,推测肯能有转录后翻译阶段的调节因素;激活的小胶质细胞HO-1 mRNA水平随时间逐渐升高,HO-1蛋白也逐渐升高;G-CSF可通过促进CD163/HO-1 mRNA合成,使CD163/HO-1在小胶质细胞中高表达而促进血红蛋白的吸收和代谢,在脑出血后起到神经保护作用,这也可能是其发挥调节小胶质细胞致炎作用的途径之一。