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研究背景与目的外泌体(exosomes)是一类可由多种活细胞通过细胞内出芽形成的多泡体(MVB)途径主动分泌至外基质的纳米级小囊泡,其直径大致位于50-200nm之间,主要结构为磷脂双分子层膜和其内包裹的蛋白质,核酸,脂类等生物信息物质。Exosomes可由体外培养的活细胞分泌至细胞培养上清液中,同时也可由体内各种活细胞分泌至人体各类体液标本中,如血清、尿液等。Exosomes可通过体液将其内包裹的核酸、蛋白质等生物大分子远距离转运至靶细胞,通过内吞或配体结合等方式使生物信息分子进入靶细胞,发挥相应功能,调控机体多种生理过程。除此之外,exosomes的浓度、粒径分布和内容物均会随机体生理状态和疾病进展发生变化,是极具应用潜力的循环疾病标志物,然而目前exosomes及exo-RNA、蛋白质分离提取方法尚未标准化,尚存纯化方法种类繁多,对现有不同方法提取所得exosomes及exo-RNA质量进行综合比较,选取适宜的分离方法以便后续机制和循环标志物研究具有重要的实用意义。Exosomes的分离纯化方法中,应用最早且最广的方法为差速超高速离心法,其根据exosomes体积和物理性质分离exosomes,在对标本进行一系列低速离心去除标本中的细胞碎片后利用>1 00,OO0g的离心力使exosomes沉淀于管底。差速超高速离心法改良后发展为蔗糖密度梯度离心法,将离心力与粒子的沉降系数结合共同分离纯化exosomes。除此之外,超高速离心法还可与超滤法、免疫吸附法等方法配合使用,以获得浓度和纯度更高的exosomes。由于传统超高速离心法需要昂贵的超高速离心机,且提取过程耗时,近年来衍生了一些新研发的商品化试剂盒,如Exoquick试剂盒和Total Exosomes Isolatin Reagent(TEI)试剂盒,试剂盒利用亲和性沉淀的原理利用试剂直接将exosomes沉淀至管底,具有操作简便、节约时间、不依赖大型仪器的特点。在获得纯度和浓度足够的exosomes后,需要进一步对其内容物如RNA进行分析。Exosomes中RNA提取方法种类繁多,常规提取方法包括酚类裂解液裂解后利用有机溶剂(氯仿)相分离,最后醇类沉淀的方法,如传统的TRIZOL-LS法;酚类裂解液与滤柱结合法,经过裂解和相分离后,取RNA水相加至滤柱,利用膜吸附作用和缓冲液进一步纯化RNA,如TER试剂盒,HLR试剂盒和miRNeasy试剂盒[1];非酚类裂解液与滤柱结合方法,利用非酚类裂解液裂解exosomes后裂解液无需相分离过程直接过滤柱,如SeraMir试剂盒法;除此之外Qiagen公司近年来新研发的exoRNeasy是专门用于提取血清中exo-RNA的试剂盒,该方法无需经过exosomes纯化过程,可利用亲和性滤膜一步法直接从血清/血浆标本中分离exosomes中RNA,操作简便快捷。Exosomes应用于临床诊断和病情监测,首先需要提取到高质量、高纯度、产量大的exosomes和exo-RNA进行分析,因此本研究选取目前应用较广泛的exosomes及exo-RNA提取方法,分别提取细胞上清液和血清来源exosomes及exo-RNA,根据exosomes的产量纯度,exo-RNA浓度及片段分布,以及不同方法提取exo-RNA中miRNA表达情况,综合评价比较各方法优缺点,为exosomes及exo-RNA应用与临床诊断提供技术支持。本研究主要分为以下三个部分:第一部分利用不同方法提取细胞上清与血清来源外泌体及方法间提取效率的比较一、实验目的综合比较传统超高速离心法和分别来自System Biosciences和Invitrogen公司的ExoQuick与TEI试剂盒这三种exosomes提取方法,为细胞上清液和血清中外泌体提取方法的选择提供建议。二、实验方法1.提取细胞上清液与血清中exosomes:经过前处理步骤的细胞上清液和人血清样本,分别按步骤利用超高速离心法和ExoQuick与TEI试剂盒提取exosomes。2.利用透射电子显微镜(TEM)观察不同方法提取细胞上清液和血清来源exosomes的形态和背景,比较不同方法提取exosomes形态和大小差异。3.Exosome蛋白定量和Western Blot:利用Bradford法检测各方法提取细胞上清液和血清来源exosomes蛋白浓度;利用Western Blot检测exosomes特异性标志蛋白CD9,CD63和TSG101表达水平。4.纳米粒度分析仪(NTA)检测exosomes浓度与粒径分布:利用NTA软件记录exosomes悬液中每一个颗粒的布朗运动,对每个颗粒定位,并且跟踪其中心运动的轨迹,计算平均位移,得到颗粒粒径的数量和大小分布信息,绘制出颗粒数量-浓度二维图谱。三、实验结果TEM观察显示三种方法均可提取到形态结构无明显差别的exosomes;Nanosight结果显示超高速离心法提取exosomes浓度较低,直径分布较不均一,而Exoquick和TEI法提取exosomes浓度较高,直径分布差异较小;蛋白定量结果显示,Exoquick和TEI法提取的细胞上清液和血清exosomes蛋白浓度均较超高速离心法高;WB结果显示,Exoquick和TEI法提取细胞上清液来源exosomes仅表达CD63和TSG101两种蛋白,提取血清来源exosomes仅表达TSG101蛋白,而超高速离心法提取的细胞上清液和血清来源exosomes同时表达3种标志性蛋白;exosomes数目/蛋白浓度比值低说明样本可能存在蛋白污染,超高速离心法exosomes数目/蛋白浓度比值高于两种试剂盒法。四、结论传统超高速离心法操作费时,提取exosomes样本需较大原始标本量,回收率较低,但此法对exosomes蛋白质分离影响较少,适用于起始体积大的样本如细胞上清液、尿液等样本蛋白组学方面研究;而试剂盒提取方法可从少量标本中提取到浓度较高的exosomes,操作简便,其亲和沉淀原理易引入蛋白质污染不适于蛋白分析,适用于小样本量样本如血清exosomes制备及后续RNA方面的研究。第二部分不同外泌体RNA提取方法对RNA样本浓度与片段分布的影响一、实验目的探讨Trizol-LS法、SeraMir试剂盒、HLR试剂盒、TER试剂盒、miRNeasy试剂盒、exoRNeasy试剂盒与3种exosomes提取方法组合分别提取细胞上清液和血清来源exosomes中RNA,比较exo-RNA的浓度和片段分布,为细胞上清液和血清来源exo-RNA提取方法的选择提供建议。二、实验方法1.分别利用不同RNA抽提方法与exosomes提取方法结合提取细胞上清和血清来源exosome中总RNA:超高速离心法分别与Trizol-LS法和SeraMir试剂盒配合、ExoQuick-TC试剂盒分别与SeraMir和HLR试剂盒配合、TEI-A与TER试剂盒配合共5种方法提取细胞上清液来源exo-RNA;用超高速离心法与Trizol-LS法配合、ExoQuick试剂盒分别与SeraMir、HLR和miRNeasy试剂盒配合、TEI-B与TER试剂盒配合及exoRNeasy试剂盒共6种方法提取血清来源 exo-RNA。2.利用Nanodrop 2000检测各方法提取Exo-RNA浓度,比较exo-RNA提取效率。3.Agilent 2100生物分析仪检测各方法提取Exo-RNA片段分布范围:比较各方法提取细胞上清液和血清中exo-RNA的电泳样条带深浅与条带分布范围,评价各提取方法exo-RNA分布特点。三、实验结果1.不同提取方法对细胞上清液来源exo-RNA浓度与分布的影响:ExoQuick-TC与SeraMir试剂盒配合提取细胞上清液exo-RNA平均浓度最高,其次为TEI-A与TER试剂盒法和ExoQuick-TC与HLR试剂盒法;超高速离心法与Trizol-LS法或SeraMir试剂盒配合提取exo-RNA浓度均较低。大部分细胞上清液来源Exo-RNA均小于200nt,ExoQuick-TC与HLR试剂盒配合、TEI-A与TER试剂盒配合提取exo-RNA可观察到小RNA区域浓集条带,且无线粒体RNA条带污染;超高速离心法与Trizol-LS法或SeraMir试剂盒配合、ExoQuick-TC与SeraMir试剂盒配合除了小RNA区域有浓集条带外,在18s和28s线粒体区域还可观察到长链RNA分布。2.不同提取方法对血清来源exo-RNA浓度与分布的影响:ExoQuick与HLR试剂盒法、TEI-B+TER试剂盒法和ExoRNeasy试剂盒法提取血清exo-RNA浓度较高。各提取方法所得血清exo-RNA均未见18s和28s线粒体区域有条带污染;ExoRNeasy试剂盒提取的exo-RNA在小RNA区域可观察到浓集的条带;ExoQuick试剂盒分别与SeraMir、HLR和miRNeasy试剂盒配合提取exo-RNA均可见100nt左右有部分RNA条带,条带颜色较淡且分布较为分散;超高速离心法与Trizol-LS法、TEI-B与TER试剂盒法电泳图无明显条带。四、结论细胞上清exo-RNA提取方法中:ExoQuick-TC与SeraMir试剂盒配合提取exo-RNA浓度最高,除了数量较为丰富的小RNA外还可看到大量大片段RNA,适用于exosomes总RNA方面的研究;ExoQuick-TC与HLR试剂盒、TEI-A与TER试剂盒法提取exo-RNA浓度相对较高且能够观察到较为富集的小RNA区带,适用于exosomes小RNA方面研究。血清exo-RNA提取方法中:ExoRNeasy试剂盒提取的exo-RNA在小RNA区域有较浓集且分布较窄的小RNA条带,另外可直接从血清标本中获取exo-RNA,适用于直接分离临床血清标本或经过超滤浓缩的细胞上清液中的exo-RNA;ExoQuick与HLR法提取RNA浓度较高且可观察到部分小RNA区带,也可推荐用于提取血清中exo-RNA。第三部分不同外泌体RNA提取方法对外泌体miRNA表达谱的影响一、实验目的应用高通量测序技术和实时荧光定量核酸扩增系统检测不同方法提取细胞上清液和血清来源exo-RNA中miRNA表达情况,为exosomes中miRNA应用于临床诊断与机制研究提供技术支持。二、实验方法1.高通量测序技术检测不同方法提取细胞上清液来源exo-RNA中小RNA表达水平:分别利用超高速离心法与Trizol-LS法、ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒、TEI试剂盒与TER试剂盒提取细胞上清来源exo-RNA,进行小RNA建库、测序和生物信息学分析,比较不同提取方法是否影响小RNA文库中各RNA 比例和miRNA表达谱。2.实时荧光定量核酸扩增系统检测不同方法提取血清来源exo-RNA中miRNA表达水平:分别利用超高速离心法与Trizol-LS法配合、ExoQuick试剂盒分别与SeraMir、HLR试剂盒配合、TEI-B与TER试剂盒配合及exoRNeasy试剂盒共5种方法提取血清来源exo-RNA,进行miRNA逆转录后进行实时荧光定量分析检测miR-16,miR-21,miR-27b和miR-101表达水平。三、实验结果1.不同方法提取细胞上清液来源exo-RNA中RNA构成比与miRNA表达谱不同:不同方法提取exo-RNA文库中小RNA种类基本相同,而各类RNA在不同方法提取exo-RNA文库中所占比例不同,超高速离心法与Trizol-LS法建库所得RNA文库中rRNA含量最高,而ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒、TEI试剂盒与TER试剂盒提取RNA文库中tRNA含量最高;对三个文库miRNA表达谱进行相关性分析,ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒、TEI试剂盒与TER试剂盒测得miRNA表达谱较为相似;三个小RNA文库中,ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒、TEI试剂盒与TER试剂盒提取exo-RNA文库中能匹配到人类基因组的净读数比例和miRNA占总RNA 比例较超高速离心法与Trizol-LS法更高。2.不同方法提取血清来源exo-RNA中同一 miRNA表达存在差异:exoRNeasy试剂盒法提取RNA中除了 miR101表达水平偏低外,另外三种miRNA表达水平均列于几种方法前列;TEI 试剂盒与TER试剂盒法所得RNA中不同miRNA表达水平均为各方法中间水平,结果较稳定;超高速离心法与Trizol-LS法,ExoQuick试剂盒与SeraMi试剂盒法和ExoQuick试剂盒与HLR试剂盒法提取不同miRNA表达水平高低均有,未见明显规律。四、结论细胞上清液exo-RNA提取方法中,ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒法和TEI试剂盒与TER试剂盒法相对于超高速离心法与Trizol-LS法更适合exoRNA提取和后续小RNA测序,特别是miRNA测序,ExoQuick试剂盒与SeraMir试剂盒法和TEI试剂盒与TER试剂盒法提取exo-RNA中小RNA构成比和miRNA表达谱相似可能由于两方法提取原理相似所致。不同方法提取同一血清exo-RNA中相同miRNA表达水平不同,可能由于不同方法对miRNA提取亲和性有差异所致。