赖氨酸特异的脱甲基酶1(也称为LSD1,BHC110或者AOF2)是第一个发现的组蛋白脱甲基酶。在CoREST(corepressor for REST)、BHC80和HADC等辅助因子帮助下,LSD1能够使组蛋白H3-K4位脱去一个或二个甲基。组蛋白脱甲基后引起染色质重塑或改变靶基因的转录活性。通常H3-K4脱甲基化抑制靶基因转录活性,而H3-K9脱甲基化则导致靶基因转录被激活。LSD1与很多疾病有密切的关系。例如,在人肿瘤细胞中LSD1表现为沉默,而一些LSD1作用的靶基因却大量表达。这些基因在癌症的发展中有重要的作用。又如,lsd1敲除的小鼠在围产早期死亡,这也导致难以深入研究lsd1在发育过程中的作用及其机制。模式生物斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高以及其心血管、血液、消化道、肝脏、肾脏以及视觉系统与人类相应系统有许多共同点,基因组序列与人的同源性更是达到75%以上。此外,斑马鱼所需部分的氧可以通过体表渗透,因此特别适用于心血管和血液系统早期发育的研究。本课题就是利用斑马鱼作为模型来研究LSD1对于发育的影响并对其机制进行了初步的探索。第一部分LSD1在脊椎动物中的同源性及其在斑马鱼胚胎发育早期的表达LSD1的cDNA共编码689个氨基酸残基,蛋白质分子量约为110KD。生物信息学的方法聚类比较显示LSD1在脊椎动物的进化过程中,蛋白质结构非常保守(同源性＞65%)。不同物种的LSD1蛋白质分子上有两个很保守的结构域:SWIRM和FAD结构域;在斑马鱼发育中,lsd1在胚胎上表达从受精后一直持续到整个发育早期,而且lsd1的表达量始终处于高水平,特别是在神经系统中。第二部分斑马鱼中lsd1基因表达下调方法的建立本研究通过吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术(morpholino)干扰目标mRNA翻译的方法下调lsd1表达,并观察斑马鱼发育受到的影响。我们设计了两个具有剪接功能的吗啡啉修饰反义寡核苷酸,下调了lsd1基因在斑马鱼中的表达。外显子11和17是LSD1功能蛋白必需的编码序列,失去其中任何一段,LSD1即丧失脱甲基酶活性。RT—PCR结果显示外显子11和17在两种MO注射后分别被剪切掉,这也验证了吗啡啉修饰的反义寡核苷酸的有效性,说明LSD1 MO能够有效下调内源性的lsd1。此外,当斑马鱼暴露在一定浓度的PCPA(＞20μM,反环苯丙胺)中,LSD1具有的组蛋白脱甲基酶活性H3-K4(2m)也被强烈抑制。第三部分lsd1基因表达下调对斑马鱼血液系统发育的影响斑马鱼是研究血管和造血的良好模型,常被应用于血管异常和造血障碍的研究。体外实验提示LSD1对于血细胞的分化起着重要作用。因为在小鼠模型中致死性,所以原始造血系统功能与LSD1的关系了解不多。我们利用斑马鱼第一次发现PCPA可以诱导斑马鱼的贫血现象,进一步研究显示贫血是由于原始造血系统被抑制造成的。这种贫血现象是由于与LSD1相关的表观遗传学变化引起的;吗啡啉下调lsd1后,斑马鱼中出现了相似的贫血表型。表明原始造血系统的发育需要LSD1的H3K4脱甲基酶参与。制备sc1、lmo2、gata2、gata1、globin、pu.1、mpx、L-plastin和flk1探针进行了胚胎整体原位杂交。结果显示,血管发育基本不受影响,但是原始红系细胞数量减少。红系发育受阻的同时髓系发育则基本无影响。此外,血细胞流动速度也受到影响。第四部分lsd1基因表达下调对斑马鱼神经系统发育的影响lsd1在斑马鱼的CNS部位持续高表达表明LSD1在神经系统发育上有一定的作用。PCPA曾作为临床上使用的抑郁药,因对患者有副作用导致使用范围减小。可是副作用分子机制不详。据报道,PCPA可以共价结合LSD1蛋白的FAD结构域从而对其酶活性产生不可逆的抑制,从而调控与神经发育相关的基因。我们观察到浓度大于或等于75μM的PCPA处理的斑马鱼较对照组活跃程度下降。原位杂交显示soxla和huc的表达水平下调,TUNEL检测结果说明上述现象是由于神经元细胞过度凋亡。注射LSD1吗啡啉后胚胎神经细胞也表现为过渡凋亡。RT-PCR结果显示,P53依赖的信号通路参与了LSD1介导的凋亡过程。