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目的:本实验验证由光敏剂——亚甲基蓝(methylene blue,MB)介导的光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)对变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)生物膜的抑制作用,并研究MB-PDT疗法对变形链球菌生物膜致龋相关基因表达的影响,以探寻MB-PDT疗法的灭菌原理及分子机制,为MD-PDT疗法在口腔防龋中的应用提供理论依据。方法:1.MB-PDT抑制变形链球菌生物膜生长的研究:使用变形链球菌在玻片上建立变形链球菌生物膜模型,根据不同处理方法将其分为3组,分别为:(1)MB-PDT处理组(MB浓度为50μg/ml,孵育时间为10min;激光波长为650 nm,能量密度为30.4 J/cm~2);(2)单纯MB处理组(MB浓度为50μg/ml,孵育时间为10 min);(3)生理盐水对照组。按照各组实验方法对生物膜模型进行处理,活死菌染色并置于激光共聚焦显微镜下观察各组生物膜形态,同时进行图像信息采集,应用软件处理图像后计算活菌与死菌的荧光比例,得出各组活死菌率。2.MB-PDT对变形链球菌生物膜致龋毒力因子影响的研究:按照上述相同方法建立变形链球菌生物膜模型并进行分组,将各组样本处理后继续培养48h,收集各组变形链球菌生物膜,使用实时荧光定量PCR检测各组gtf B、gbp A、gbp B、gbp C、gbp D和ffh等致龋相关基因的表达量。结果:1.MB-PDT抑制变形链球菌生物膜生长的研究:对处理后的样本进行活死菌染色并在激光共聚焦显微镜下观察,可见MD-PDT组图中仅有少量散在绿色染色,大面积红色染色,说明MB-PDT处理后生物膜内大量细菌死亡,有较好的抑制效果。MB组图中存在大面积绿色染色,较少的红色染色,表明单独MB处理后生物膜内仍存在大量活菌;生理盐水组图像与MB组相似,绿色染色占大多数,表明观察区域内的生物膜有大量活菌存在,死菌较少;通过对图像进行处理并计算出每组样本绿色信号强度占红色绿色信号强度总和的比,即活菌比例。结果显示MB-PDT组与生理盐水组相比活菌比例明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);MB组与生理盐水组之间的差异没有统计学意义(p>0.05);MB-PDT组与MB组相比活菌比例同样有明显的降低,差异有统计学意义(p<0.05)。2.MB-PDT对变形链球菌生物膜致龋毒力因子影响的研究:实时荧光定量PCR的结果表明MB-PDT组与生理盐水组相比变形链球菌gtf B、gbp A、gbp B、gbp C和gbp D的基因表达量均有降低(p<0.05),ffh的表达未见明显差异(p>0.05)。MB组与生理盐水组相比变形链球菌gtf B、gbp A、gbp B、gbp C和gbp D的基因表达量未见明显差异(p>0.05),ffh的基因表达量略有升高(p<0.05)。而MB-PDT组与MB组相比变形链球菌gtf B、gbp A、gbp B和gbp C的基因表达量均有明显降低(p<0.05),gbp D和ffh的表达未见明显差异(p>0.05)。结论:结合本实验条件下对变形链球菌生物膜进行MB-PDT处理后的各项检测结果可得出结论,MB-PDT疗法对生物膜中的变形链球菌有良好的灭菌效果,能够明显抑制其生物膜的活性。MB-PDT疗法能够降低变形链球菌致龋相关基因gtf B、gbp A、gbp B、gbp C和gbp D的表达,推测MB-PDT的防龋机制主要为减少变形链球菌细胞外基质的分泌,降低葡聚糖的合成、破坏生物膜结构稳定性及降低形成生物膜的内聚力,进而达到降低细菌活性抑制生物膜致龋的目的。