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启动子是控制基因转录的调控片段。组织特异性启动子是在特定组织和器官中特异性表达基因的启动子。组织特异性启动子在遗传育种及性状改良等应用方面显示出极高的价值。本试验采用猪肌肉特异性基因MyoG的启动子驱动与脂质代谢密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体基因在肌肉中异位表达;采用猪肝脏特异性基因α1-AT启动子以及α1-AT基因的信号肽驱动来源于扣囊复膜酵母的β-葡萄糖苷酶基因在肝脏中异位表达。为构建转基因小鼠模型提供一定的理论基础。取得的主要研究成果如下:1.采用在线软件MEME比对猪、人和小鼠相同区域序列,确定猪MyoG启动子的功能区域位于第一外显子5端附近。克隆猪MyoG基因5’侧翼806bp序列,TESS和TFSEARCH等分析该片段含有启动子的特征元件TATA box和多个转录因子结合位点,如Sp1、E-box、C/EBP、NF-1、Myogenin等。构建含有MyoG启动子的pGL3-MyoG报告质粒,分别转染分化Od、2d、3d、4d、6d的C2C12细胞和3T3-L1细胞。发现MyoG启动子活性在C2C12细胞分化3天时达到最大,随着分化时间的延长,其活性逐渐降低;在3T3-L1细胞中,其活性与阴性对照无显著差异。将转录因子MyoD与pGL3-MyoG以及pGL3-MyoG突变载体共转染分化的C2C12细胞,发现MyoD可以提高启动子的转录活性,并通过EMSA验证MyoD与启动子的结合。2.构建猪MyoG启动子和猪PPARγ基因的重组表达载体,使用荧光定量PCR及Western Blot检测PPARγ在C2C12细胞中的表达水平。结果显示,在MyoG启动子的驱动下,PPARγ在C2C12细胞中的蛋白水平表达量较阴性对照组提高2倍左右。为制备转基因小鼠,线性化处理pGL3-MyoG-PPARγ重组质粒,线性化片段以MyoG启动子为调控区域,以带有Flag标签的PPARγCDS为表达区域,保留pGL3-Basic载体上的poly(A)元件,显微注射小鼠受精卵,得到PCR鉴定为阳性的转基因小鼠4只(4雄)。3.构建含有猪CKM(creatine kinase,muscle)增强子和猪MyoG启动子的报告质粒,分别转染分化的C2C12以及3T3-L1细胞。结果表明,猪CKM增强子能显著地提高MyoG启动子活性。在3T3-L1细胞中,嵌合启动子表现出组织特异性,其活性与阴性对照无显著差异。此载体的构建为解决转基因过程中需要高效率以及特异性表达问题提供了一定的基础。4.分析α1-AT基因上游调控序列,利用在线软件预测分析该片段含有一些影响启动子转录活性转录因子结合位点,如Sp1、Ap1、NF-Kap等;且含有组织特异性转录因子结合位点HNF-3b。根据预测结果成功克隆猪α1-AT基因5’侧翼1661bp序列,构建含有α1-AT启动子的pGL3-AT双荧光素酶报告质粒,分别转染Hepa1-6、3T3-L1以及PK15细胞系,α1-AT启动子缺失片段2不仅活性最高,且保持了组织特异性这一特征。所以认为α1-AT启动子缺失片段2为具有肝脏特异性的活性启动子。5.构建猪α1-AT启动子缺失片段2和BGL1基因的重组表达载体,通过荧光定量PCR及Western Blot检测BGL1在Hepa1-6细胞中表达水平。结果显示,在α1-AT启动子的驱动下,BGL1在Hepa1-6细胞中的蛋白质水平表达量与阴性对照有显著性差异。