BAK1特异突变体互作组分的筛选

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zxbleng
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
拟南芥BAK1是一个多功能受体激酶,在多条信号通路如BR信号、植物先天免疫、细胞死亡及生长发育等路径中发挥重要功能。对其激酶活性及磷酸化位点的研究有助于进一步揭示BAK1同其它组分相互作用并在不同的信号路径中发挥作用的分子机理。本研究将BAK1-flag-WT(W)、激酶无活性BAK1-flag-K317E(E)以及特异突变体BAK1-f0ag-A/D(A/D)的胞内激酶域体外原核表达,对其激酶活性进行研究,并通过MBP pull-down方法从BAK1已鉴定的互作组分中筛选BAK1(W/E)和特异突变体(A/D)的差异互作组分;另外对BAK1转基因植株的活体磷酸化水平进行了检测;在此基础上,对番茄SIBA1基因进行了生物信息分析。取得的主要结果如下:1.BAK1激酶活性研究(1)BAK1野生型及其突变体体外原核表达在不同诱导温度下激酶活性及蛋白修饰存在差异。室温25℃或30℃诱导时,W及A均出现自磷酸化,并且发生一种未知的蛋白修饰,在SDS-PAGE胶中均出现两条目标带;37℃诱导时,W和A表现出明显差异,此时W仍表现出两条目标带,有强烈的自磷酸化修饰,而A仅有一条分子量较小的目标带,且自磷酸化程度较弱。各种诱导温度下,D和E均表现出激酶无活性,仅一条非磷酸化修饰的目标带。(2)BAK1激酶区在大肠杆菌的原核表达引起寄主细胞生长抑制,且受激酶活性影响。W,E,A,D原核表达在IPTG诱导浓度为0.01 mM时,W菌落明显变小,A和D,E与正常菌落大小没有明显差异;当IPTG诱导浓度为到0.10mM时,W和A均没有菌落形成,D和E生长均被抑制,菌落显著变小。这一结果对应于BAK1在活体中负向调控细胞死亡信号路径,并且与激酶活性相关联。2.BAK1特异突变体互作组分的筛选(1)BAK1特异突变体的蛋白互作因诱导温度不同而产生差异。不同温度诱导的W均能与 PUB13-MBP,FLS2-MBP,PP2A-MBP,PEPR1/2,Atlg09640-MBP,BRI1-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 互作,其中 Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 的互作较弱。30 ℃诱导的A均能同以上组分互作,但37 ℃诱导的A仅与PUB13-MBP、BRI1-MBP有强烈的互作,与其他组分不互作或是互作很弱。(2)蛋白修饰影响蛋白的互作。蛋白修饰影响蛋白互作的差异主要表现在Western Blot检测到的目标条带的差异。部分蛋白如FLS2-MBP,PP2A-MBP,PEPR1/2,BRI1-MBP仅与被修饰过的W和A蛋白结合,即Western Blot检测到的是分子量较大的条带;部分蛋白 PUB13-MBP,Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 与 W 互作后能检测到两条目标条带,说明修饰或未修饰的蛋白均能产生互作;部分蛋白PUB13-MBP,Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 仅与未修饰的 A 互作,即检测到的是分子量较小的目标带,说明蛋白修饰对蛋白互作极其重要。3.BAK1转基因植株活体磷酸化水平检测BAK1拟南芥过表达液培小苗使用flg22,Epi-BL,H202,NaCl,Basta等处理后免疫沉淀得到纯化蛋白,Westen Blot检测磷酸化水平。结果表明,flg22,Epi-BL及环境因子处理会使磷酸化发生变化,说明BAK1的磷酸化水平受多种因子的影响。4.番茄SIBAK1的生物信息学分析氨基酸序列及其蛋白结构分析表明SIBAK1与AtBAK1同源性很高,属于富亮氨酸受体激酶,且有相同的激酶结构域,预示着SIBAK1与AtBAK1有相似的生物学功能。
其他文献
高光谱遥感技术能同时得到成像区域内地物的空间和光谱信息,已被应用在环境监测,自然灾害监测等领域。由于传感器空间分辨率偏低和地物多样性的影响,获取的图像中有大量混合像元存在,混合像元的存在阻碍了遥感技术向着定量化发展,已经成为高光谱遥感领域的难题之一。处理混合像元最有效的方法就是对混合像元分解(解混)。分解的目的是得到“纯净”光谱(端元)及其比例(丰度)。基于非负矩阵分解(NMF)技术的解混模型是近
以新疆为典型代表的我国西北寒区冬季时间长,降雪量大,低等级公路里程长、占比大,积雪清理不及时,路面极易产生积雪、结冰等不利行车现象。驾驶人遇此类冰雪道路环境难以自主驾驭安全车速而导致常发各类交通事故,且交通管理者也常难于无执法依据可循。因此,对不同路面冰雪状态进行实时检测识别,并以动态限速标志牌的形式为驾驶人和交通管理者提供当前路面状态下的安全限速权限值尤显重要。目前,国内外学者对于冰雪路面状态检
自2008年北京奥运会、2010上海世博会以来,我国空间结构技术得到了进一步发展。伴随着政治、文化等领域的需要,各类形体庞大、结构复杂并且富有艺术感、风格多样、造型独特的
自从改革开放以来,我国农村发生了翻天覆地的重大变化,主要体现在经济结构的调整、人们思想观念的改变和社会生活的改善三个方面。城市化进程的不断深入和计划生育这一重大决
语音情感识别是人工智能领域的人机交互和机器的智能化研究中的一个重要分支。语音情感识别主要包含语音库的建立,情感特征的提取,语音特征选择,情感识别。情感特征的提取和
本翻译报告选自《单车穿越亚洲》(Across Asia on a Bicycle)汉译节选翻译实践。该文本属于游记类文本,主要讲述了两位美国大学生骑自行车,自君士坦丁堡到北京,穿越亚洲的旅程。节选为该文本的第一章节,主要介绍两位作者在亚洲土耳其经历的风土人情。节选部分以叙述、描写为主,议论、说明为辅,其中涉及大量人名、地名等专有名词,语言风格幽默且讽刺。通过对原文文本分析,笔者发现需解决专有名词的
海工装备重装拖曳系统广泛应用于声呐拖曳、海洋勘探等领域,海上进行拖曳系统相关试验周期长,风险大,成本高;受海况影响,海上试验不利于长时间进行和反复验证;与海上试验相比,陆上试验室通过负载模拟加载系统对拖曳系统进行试验,具有风险可控、重复性好、成本低等优点。本文采用理论分析、软件仿真和实验研究相结合的研究方法,以前期海上试验的数据为基础和准则,探究拖曳系统振动特性和负载特性,提出了陆上拖曳负载模拟系
类电磁机制(Electromagnetism-like mechanism,EM)算法是由S.I.Birbil和S.C.Fang于2003年提出的一种智能优化算法。其优化思想是模拟电磁场中带电粒子之间的吸引-排斥机制,寻
我国要大力发展可再生能源,但风电、光伏发电等可再生能源具有间歇性、随机性和反调节特性,影响电网安全稳定运行;加之我国用电负荷高峰的逐年增长和峰谷差的不断拉大,系统的
背景和目的:随着对女性盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)研究的逐渐深入,治疗方式越来越多,其中手术治疗在有症状的POP患者中占据重要的地位。网片因其可增加盆底薄弱组织的支持力,提高POP手术的解剖结构治愈率,在POP手术中被广泛采用。但随着网片相关并发症等不良事件报道逐年增加,美国FDA不再推荐在经阴道POP修补术中使用网片,但国内经阴道网片植入术使用率似乎并未降低