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拟南芥BAK1是一个多功能受体激酶,在多条信号通路如BR信号、植物先天免疫、细胞死亡及生长发育等路径中发挥重要功能。对其激酶活性及磷酸化位点的研究有助于进一步揭示BAK1同其它组分相互作用并在不同的信号路径中发挥作用的分子机理。本研究将BAK1-flag-WT(W)、激酶无活性BAK1-flag-K317E(E)以及特异突变体BAK1-f0ag-A/D(A/D)的胞内激酶域体外原核表达,对其激酶活性进行研究,并通过MBP pull-down方法从BAK1已鉴定的互作组分中筛选BAK1(W/E)和特异突变体(A/D)的差异互作组分;另外对BAK1转基因植株的活体磷酸化水平进行了检测;在此基础上,对番茄SIBA1基因进行了生物信息分析。取得的主要结果如下:1.BAK1激酶活性研究(1)BAK1野生型及其突变体体外原核表达在不同诱导温度下激酶活性及蛋白修饰存在差异。室温25℃或30℃诱导时,W及A均出现自磷酸化,并且发生一种未知的蛋白修饰,在SDS-PAGE胶中均出现两条目标带;37℃诱导时,W和A表现出明显差异,此时W仍表现出两条目标带,有强烈的自磷酸化修饰,而A仅有一条分子量较小的目标带,且自磷酸化程度较弱。各种诱导温度下,D和E均表现出激酶无活性,仅一条非磷酸化修饰的目标带。(2)BAK1激酶区在大肠杆菌的原核表达引起寄主细胞生长抑制,且受激酶活性影响。W,E,A,D原核表达在IPTG诱导浓度为0.01 mM时,W菌落明显变小,A和D,E与正常菌落大小没有明显差异;当IPTG诱导浓度为到0.10mM时,W和A均没有菌落形成,D和E生长均被抑制,菌落显著变小。这一结果对应于BAK1在活体中负向调控细胞死亡信号路径,并且与激酶活性相关联。2.BAK1特异突变体互作组分的筛选(1)BAK1特异突变体的蛋白互作因诱导温度不同而产生差异。不同温度诱导的W均能与 PUB13-MBP,FLS2-MBP,PP2A-MBP,PEPR1/2,Atlg09640-MBP,BRI1-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 互作,其中 Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 的互作较弱。30 ℃诱导的A均能同以上组分互作,但37 ℃诱导的A仅与PUB13-MBP、BRI1-MBP有强烈的互作,与其他组分不互作或是互作很弱。(2)蛋白修饰影响蛋白的互作。蛋白修饰影响蛋白互作的差异主要表现在Western Blot检测到的目标条带的差异。部分蛋白如FLS2-MBP,PP2A-MBP,PEPR1/2,BRI1-MBP仅与被修饰过的W和A蛋白结合,即Western Blot检测到的是分子量较大的条带;部分蛋白 PUB13-MBP,Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 与 W 互作后能检测到两条目标条带,说明修饰或未修饰的蛋白均能产生互作;部分蛋白PUB13-MBP,Atlg09640-MBP,GSTF10-MBP,GST-MBP 仅与未修饰的 A 互作,即检测到的是分子量较小的目标带,说明蛋白修饰对蛋白互作极其重要。3.BAK1转基因植株活体磷酸化水平检测BAK1拟南芥过表达液培小苗使用flg22,Epi-BL,H202,NaCl,Basta等处理后免疫沉淀得到纯化蛋白,Westen Blot检测磷酸化水平。结果表明,flg22,Epi-BL及环境因子处理会使磷酸化发生变化,说明BAK1的磷酸化水平受多种因子的影响。4.番茄SIBAK1的生物信息学分析氨基酸序列及其蛋白结构分析表明SIBAK1与AtBAK1同源性很高,属于富亮氨酸受体激酶,且有相同的激酶结构域,预示着SIBAK1与AtBAK1有相似的生物学功能。