第一部分盐酸阿比朵尔抗柯萨奇病毒的药效学研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种无包膜、单正链RNA病毒,可引起心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、手足口病等,其中以病毒性心肌炎最为严重。B组柯萨奇病毒(CB)是病毒性心肌炎的主要致病因素,以CB3和CB5危害最大。除病毒对心肌的直接损伤外,炎症和免疫反应也是致病的关键性因素。故CB感染早期除应用抗病毒药物外,还可应用免疫调节剂,通过调节机体的免疫反应保护心肌。对CB感染,临床上目前无特效预防和治疗手段。盐酸阿比朵尔(ARB)是一种新的免疫刺激剂,具有诱生干扰素和活化巨噬细胞的特性。我们前期的研究结果显示ARB对流感病毒、呼吸道合胞病毒、汉坦病毒等多种有包膜RNA病毒具有抑制作用,其抗病毒方式是多途径的,本研究我们拟探讨ARB抗无包膜RNA病毒—CB5的药效及可能作用机制。目的：探讨ARB体外抗CB5的活性及抗病毒作用方式,利用CB5感染小鼠模型,进一步研究ARB体内抗病毒效果。方法：实验分两个阶段。先用MTT比色法检测ARB对HEp-2细胞的毒性作用；在微量细胞培养板上,通过观察细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE).MTT法检测病毒抑制率从ARB抑制病毒感染细胞、ARB直接杀伤病毒和ARB对病毒穿入细胞后的抑制作用三方面检测ARB抑制CB5的活性；同时ELISA检测ARB体外诱导干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)的能力；半定量RT-PCR检测不同剂量ARB对CB5mRNA表达的影响。第二阶段,利用BALB/c小鼠建立感染模型,选择ARB两个剂量组(0.025g·kg-1·d-、0.050g·kg-1·d-1)对病毒感染小鼠进行治疗,CB5腹腔接种后24h开始灌胃给药,连续给药6d,通过观察病毒感染后30d内小鼠体重变化情况及生存率,测定感染后第7d小鼠心、肺病毒滴度,观察组织病变程度,评价ARB体内抗CB5作用。结果：1.在1-16μg/mL的浓度范围内,随着药物浓度的增加,ARB抗病毒活性增强,且ARB直接杀伤病毒和病毒进入细胞后抗病毒生物合成作用较强,对CB5的半数有效浓度(50% inhibitory concentrations,IC50)分别为2.66±0.4μg/mL和6.62±1.1μg/mL。与病毒对照孔相比,ARB> 8μg/mL可以明显抑制CB5感染的HEp-2细胞出现CPE。2. RT-PCR结果显示5μg/mL和10μg/mLARB作用后,病毒mRNA表达量下降明显,与病毒对照组相比,有统计学差异(p<0.05)。3.2-16μg/mL ARB作用HEp-2细胞24h,不能诱生细胞产生IFN-β。4.CB5腹腔注射后24h开始灌胃给药,连续给药6d,0.025g·kg-1·d-1ARB治疗组动物心脏病变明显轻于病毒对照组,心、肺组织出血、水肿症状均明显减轻；0.050g·kg-1·d-1ARB治疗组小鼠心肌组织未见明显病变。空斑滴定结果显示0.025g·kg-·d-、0.050g·kg-1·d-’ARB治疗组小鼠心脏病毒滴度分别为103和102PFU,与病毒对照组(105PFU)相比,下降明显(p<0.05)。5.正常对照组小鼠30d内未见死亡,病毒对照组小鼠从第8d开始出现死亡,18d内死亡率为100%；ARB治疗组小鼠初始死亡时间延后(第12d),0.025g·kg-1·d-1、0.050g·kg-1·d-1ARB治疗组小鼠存活率分别为62.5%和100%,各组间生存分布有统计学差异(p<0.05)。结论：1.盐酸阿比朵尔体外具有抗CB5活性,其中直接杀伤病毒和病毒进入细胞后抑制病毒生物合成作用较强。2.盐酸阿比朵尔对CB5致死性感染BALB/c小鼠具有保护作用。第二部分中性粒细胞对外周味觉功能的影响(由于本人被选参加校际合作联合培养博士生项目,赴乔治亚医学院分子医学和遗传学院学习两年半,研究方向为免疫因素对外周味觉功能的影响,故第一部分和第二部分研究内容没有直接关系,特此说明。)动物的外周味觉系统在成年期仍具有功能可塑性。单侧鼓锁神经(chorda tympani,CT)离断后24h,对侧CT神经对Na+反应性下降,48h功能恢复正常。CT神经为单侧支配,不跨越舌头的中线,是什么因素导致对侧CT神经的功能受到影响?这是一个值得进一步探讨的问题。近30年,国内外学者倾注了巨大的热情,致力于神经损伤后免疫反应的研究。各项研究表明周围神经损伤后的免疫反应对神经再生的作用具有双面性,既可促进神经生长,也有神经毒性作用。我们推测CT神经损伤后的免疫反应可能是解决问题的关键。炎症或损伤时,中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMN)作为机体“第一道防御线”迅速渗出血管,最早到达炎症部位,是组织修复的最初步骤。许多研究提示中枢或周围神经损伤可诱导PMN浸润,但PMN影响神经元或神经细胞的具体机制有待进一步研究。我们推测单侧CT神经离断能诱导舌PMN浸润,PMN可能是导致对侧CT神经功能变化的原因。目的：利用外周味觉系统这个神经退化再生模型,研究周围神经损伤后复杂的免疫反应；探讨PMN对外周味觉功能的影响,为进一步研究周围神经损伤后的天然免疫反应提供新的线索和思路；为深入阐明外周神经损伤对味觉功能的影响提供理论基础。方法：1.用免疫组织化学的方法研究单侧CT神经离断或合并低钠饮食处理后,大鼠舌内PMN反应动力学。实验分5组：1)单侧CT离断组；2)单侧CT离断合并低钠饮食组；3)低钠饮食组；4)伪手术组(手术对照)；5)正常对照组。分别于CT神经离断后12h、24h、48h和72h四个时间点杀鼠取舌,一抗针对的是髓过氧化物酶抗体(Myeloperoxidase, MPO), PMN的标志。用MetaMorph软件对舌内PMN计数。2.为验证PMN对外周味觉功能的影响,清除或抑制PMN后检测外周味觉功能的变化。CT神经离断前24h给予大鼠腹腔注射兔源抗PMN抗体,CT神经离断24h后记录对侧CT神经对各种味觉刺激的神经电生理反应；对照组大鼠腹腔注射正常兔血清(NRS)。3.为进一步验证PMN对外周味觉功能的影响,主动诱导舌PMN增高后检测外周味觉功能的变化。大鼠舌腹部皮下注射10μg脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),24h后记录注射同侧和注射对侧CT神经电生理反应。对照组大鼠给予同体积PBS舌下注射。结果：1.PMN计数结果显示,单侧CT神经离断后12h舌两侧的PMN增加并达高峰,与对照相比,舌前区神经离断侧(p<0.05)和非离断侧(p<0.05) PMN都明显增加;PMN反应24h开始回落,48h恢复正常水平(p>0.05)。CT离断合并低钠饮食的大鼠,舌两侧PMN12h增加(p<0.05),24h达高峰(p<0.001,),48h仍维持高水平(p<0.05)。2.免疫组化结果证实抗PMN抗体可抑制CT神经离断后的PMN反应。与注射NRS的对照组相比,注射PMN抗体组大鼠神经离断侧(p<0.05)和非离断侧(p<0.001)舌内PMN都明显减少。神经电生理结果也证实,清除或抑制PMN反应可恢复对侧CT神经对Na+的反应性。注射PMN抗体组大鼠对0.10 M(p=0.021)、0.25 M(p=0.003)和0.50M(p=0.010)NaCl的反应性都高于对照组；对0.1M-0.5M NaAc的反应性也明显高于对照组(p=0.026-0.048)。而且PMN对外周味觉功能的作用只特异性的针对Na+,电生理结果显示CT神经对0.05-0.5M KCl、1M蔗糖(sucrose)、0.01M奎宁(quinine)、0.01N盐酸(HCl)和0.3M谷氨酸钠(MSG)等刺激两组间反应无差异(p>0.05)。且各组CT神经对含有上皮钠通道阻滞剂—阿米洛利的NaCl溶液反应无差异(p>0.05)。3.免疫组化结果证实LPS舌下注射能诱导舌PMN增加,PMN分布于舌粘膜层、固有层和肌层。不但注射同侧(p=0.005)PMN数量增加,PMN还弥漫到注射的对侧(p=0.011)。而且PMN反应不仅局限于舌前区,舌中和舌后区PMN亦明显增加(p=0.0001-0.006)。神经电生理结果进一步证明PMN能降低CT神经对Na+的反应性。与PBS对照组相比,LPS舌下注射能显著降低CT神经对NaCl和NaAc的反应性；只要PMN增加,不论是注射同侧还是对侧,CT神经的功能都受到影响(p<0.001-0.05)；且CT神经对0.05-0.5M KCl、1M Sucrose、0.01M quinine、0.1M和0.3M MSG等刺激各组间反应无差异(p>0.05)。结论：1.外周味觉神经损伤能诱导舌PMN浸润,低钠饮食能增强PMN对神经损伤的反应强度并延长其反应时间。2.清除或抑制PMN反应能恢复CT神经对Na+的反应性。3.炎症诱导PMN也能特异性的影响外周味觉功能。