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活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态作为微生物抵御不良环境的生存机制,在污染环境中普遍存在。绝大多数微生物因进入VBNC状态而无法分离培养且难以发挥其污染物降解功能。研究VBNC状态的复苏培养、挖掘其潜在的环境功能具有重要意义。但目前针对VBNC状态的研究主要集中在医学领域,对于自然环境中功能型VBNC状态菌的相关文献较少。鉴于此,本研究首次从环境污染角度探究在高浓度污染物(苯酚)诱导下,苯酚降解真菌可培养性能、形态、生理生化及功能的变化,并测定去除苯酚胁迫后,其苯酚降解及可培养性能的恢复。其次,本研究利用金属亲和层析的方法获得纯化的复苏促进因子(resuscitation promoting factor,Rpf),依据Rpf蛋白的氨基酸排列顺序构建其蛋白空间结构从而确定溶菌酶样结构域,并通过酶谱分析和肽聚糖水解酶活性分析探究Rpf蛋白对VBNC状态菌的复苏促进作用。最后,以高氨氮废水为富集源,分离培养、鉴定Rpf蛋白添加组的特有菌株,筛选出高效好氧反硝化菌并测定其脱氮性能,以挖掘复苏菌种降解污染物的潜能。研究结果如下:(1)分离筛选获得高效苯酚降解菌株LN1,其在48 h可完全降解1000 mg/L苯酚。全基因组测序表明LN1属于假丝酵母属(Candida),且具有与苯酚降解相关的catA基因。研究表明,菌株Candida sp.LN1在6000 mg/L苯酚诱导下,14 h后进入VBNC状态,并表现出细胞膜表面皱缩、细胞长度变短(从3.44μm缩短至1.62μm)、DNA损伤、蛋白结构改变及键位氧化等变化。当去除高浓度苯酚胁迫后,LN1菌株接种至LB培养液中,12 h后可恢复其培养性能。恢复培养性能的复苏细胞,其菌体生长和苯酚降解性能与正常细胞相比几乎相同,但较正常细胞,其滞后期延长。(2)重组Rpf蛋白在Escherichia coli BL21(DE3)可稳定表达,该蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中显示出25-27 kDa的表观分子量。其次,以Rpf的氨基酸排列序列为依据,在Phyre2网站中构建的蛋白质空间结构,可信度达99.8%,该预测结构模型与具备溶菌酶样折叠的―d1xsfa1‖模型显示出48%的同一性。同时,酶谱和肽聚糖酶活性分析表明Rpf蛋白在pH为5.0,温度约为50°C时表现出最大水解酶活性。(3)以高氨氮废水为富集源,利用最大或然数(most probable numbe,MPN)法对活菌进行计数,通过对比Rpf添加组和灭活组可知,Rpf添加可使样品中活细胞数量增加58.1%。采用MPN结合稀释涂布法复苏纯化VBNC菌株,分离获得4株Rpf添加组所特有菌株,其中ZYR51归属于戈登氏菌属(Gordonia),CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63均归属于假单胞菌属(Pseudomonas)。相比其它复苏菌株,ZYR51具有最强的脱氮性能,ZYR51在120 h内氨氮去除率为86.7%,总氮去除率高达55%。本论文研究结果为探索污染环境中微生物VBNC状态的形成与复苏提供理论依据,并为挖掘潜在降解污染物的微生物资源提供新的方法。同时,为Rpf应用于生物修复领域奠定了一定基础。