目的丙型病毒性肝炎(丙型肝炎)呈全球性流行,据世界卫生组织统计,全球丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染者1.7亿,占世界人口的3%,每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。中国血清流行病学调查资料显示,我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2%。慢性丙型肝炎被认为是引起肝硬化和肝癌的主要原因,由于HCV基因型的变异度较高等诸多因素,迄今为止尚无疫苗可有效预防HCV感染,因此,丙型肝炎的有效治疗至关重要。聚乙二醇化干扰素( Peg-IFN-α)与利巴韦林(RBV)联合治疗是目前临床上丙型肝炎的标准治疗方案,但其病毒持续应答率(SVR)为48-88%,仍有很大一部分患者病毒清除失败,其中基因2或3型丙型肝炎占18%-24%,基因1丙型肝炎占54%-58%。目前临床上难治性丙型肝炎(difficult-to-treat chronic hepatitis C, DT-CHC)的诊断标准为符合下列条件之一者:基因型为HCV 1型;初次治疗无应答或复发者;病毒载量高(病毒载量>2×106拷贝/ml);合并肝硬化、胰岛素抵抗或Ⅱ型糖尿病的慢性丙型肝炎患者。鉴于我国丙型肝炎患者基因型主要以1b型为主,根据此标准,我国相当部分HCV感染者可能为难治性丙型肝炎患者。因此,研究丙型肝炎的有效治疗方法与治疗时机,提高病毒持续应答率临床意义重大,如何提高丙型肝炎病毒持续应答率已成为抗HCV治疗的研究热点。迄今为止,难治性丙型肝炎的临床、病理特点尚未明确,肝脏免疫状况对丙型肝炎病毒持续应答率的影响尚待研究,上述问题的阐明对DT-CHC的诊治意义重要。本研究通过对较大样本行肝穿刺病理检查的难治性丙型肝炎和普通性丙型肝炎(common chronic hepatitis C, C-CHC)患者的比较研究,旨在探索难治性丙型肝炎的临床、病理特点及流行病学规律,为难治性丙型肝炎的预判进而指导临床制定个性化的治疗方案提供依据;通过肝组织内Th1、Th2、Th17和Treg细胞相关调节细胞因子的研究,探讨难治性丙型肝炎的肝脏免疫状况,从肝脏免疫调节角度探讨难治性丙型肝炎的发生机制。方法选择1996年01月-2009年12月之间解放军第302医院行肝穿刺检查的连续性成人慢性丙型肝炎病例222例,根据难治性丙型肝炎的入组和排除标准分成难治性丙型肝炎组(117例)和普通性丙型肝炎组(105例);采用全自动生化仪进行肝功能及血生化指标检测;增强化学发光法和荧光定量PCR法(ROCH公司试剂盒)检测血清抗-HCV和HCV RNA水平;采用免疫组织化学和核酸原位杂交方法检测肝组织原位HCV抗原和HCV RNA表达状况;建立难治性丙型肝炎病理评价系统(炎症坏死评分0-18分,纤维化程度评分0-6分,脂肪变性分为轻、中、重3种程度,其它如胆管损伤、淋巴滤泡、浆细胞浸润等病变均以有或无表示),对难治组和普通组患者的肝穿组织进行病理学评价,比较分析难治组和普通组丙型肝炎患者临床、组织及流行病学差异,探索难治性丙型肝炎的临床、病理及流行病学特点;应用流式细胞仪(FCM)检测患者肝穿当日或一周内的外周血淋巴细胞亚群,免疫组织化学染色检测肝组织内Th1、Th2、Th17和Treg等细胞的相关标记分子,对免疫组织化学染色阳性细胞数进行图像定量分析,研究难治性丙型肝炎肝脏免疫功能状况。应用SPSS for Windows 11.5统计软件进行统计学分析。结果1.难治性丙型肝炎的临床流行病学特点普通组患者年龄16-57岁,平均年龄35.11±11.47岁,难治组患者年龄16-63岁,平均年龄34.17±14.11岁,两组病例年龄、性别均无统计学差异(P值分别=0.556、0.685)。16-19岁,难治组男性患者比例显著高于普通组(x2=5.182, P=0.046);40岁以下,难治组患者男性比例明显高于40岁以上患者男性比例(x2=12.306, P=0.001)。本研究对象中所有2a型丙型肝炎患者均源自长江以北省份,1b型丙型肝炎患者有79例(89.77%)源自长江以北省份,9例(10.23%)源自长江以南省份。难治组与普通组患者感染丙型肝炎病毒的途径无显著性差异(x2=6.042,P=0.110),主要以输血或应用血液制品为主要感染途径。2.血清和肝组织病毒学检测所有患者的血清抗-HCV均为阳性,难治组血清HCV RNA阳性114例(97.44%),普通组血清HCV RNA阳性71例(67.62%),难治组血清HCV RNA阳性者多于普通组(x2=35.422, P=0.000)。肝组织HCV RNA核酸原位杂交染色检测结果显示,难治性丙型肝炎肝组织内HCV RNA表达量显著高于普通组。3.难治性丙型肝炎的临床、病理学特点难治组血清ALT、AST水平分别为77.63±77.01、55.02±45.05,均显著高于普通组(P值分别=0.026,0.037)。难治组汇管区炎症、脂肪变性的病变程度均重于普通组(P值分别=0.036,0.012),胆管损伤、淋巴滤泡样结构出现的频度均显著高于普通组(P值分别=0.011,0.006),难治组易见窦周纤维化(P=0.038)和浆细胞浸润(x2=6.936,P=0.008)。相关统计学分析结果显示,难治组肝脏纤维化程度与肝细胞脂肪变性、血清AST和HCV RNA分别呈正相关,肝脏炎症活动度、脂肪变性、胆管损伤、淋巴滤泡样结构病变均分别与ALT、AST呈正相关。4.外周血及肝组织淋巴细胞亚群检测与普通组相比,难治组患者外周血CD3、CD4阳性细胞表达频数较高(P值分别=0.036,0.024),而CD8阳性细胞、B细胞、NK细胞表达频数两组间没有差异(P值分别=0.181,0.284,0.192);难治组患者肝组织内CD3、CD4、CD8阳性细胞数显著多于普通组(P值分别=0.032,0.004,0.033),CD20、CD56阳性细胞数两组间差异无统计学意义(P值分别=0.599,0.623)。5.肝组织内免疫细胞因子表达状况难治组患者肝组织内IL-4、IL-10、IL-6、IL-17、TNF-α阳性细胞数显著高于普通组(P值分别=0.031,0.028,0.028,0.036,0.023),IL-2、IFN-γ、TGF-β、CD4/Foxp3阳性细胞数显著低于普通组(P值分别=0.036,0.021,0.004,0.036)。难治组患者肝组织内IL-6、IL-17阳性细胞与肝脏内浆细胞浸润呈正相关,TGF-β阳性细胞与肝组织纤维化程度成正相关。结论1.难治性丙型肝炎有其相对的病理学特点,与普通性丙型肝炎相比,难治性丙型肝炎肝组织汇管区炎症及脂肪变性更严重,胆管损伤、淋巴滤泡样结构、浆细胞浸润、窦周纤维化等病理改变更易见,上述特点可能为难治性丙型肝炎抗病毒治疗持续应答率低的病理学基础。本研究所建立的丙型肝炎组织学评估系统,能够全面详细地评价丙型肝炎的病理学改变,可在临床病理评价及药物验证中进行应用。2.难治性丙型肝炎患者主要肝脏功能生化指标异常程度重于普通性丙型肝炎患者,可以为临床抗病毒治疗时机的选择和肝脏损伤程度的判定提供参考依据。难治性丙型肝炎患者中,男性患者发病年龄低于女性患者,40岁以下难治性丙型肝炎中男性患者比例明显高于女性,推测性别和年龄可能是影响丙型肝炎抗病毒治疗疗效的因素。在地理分布上,丙型肝炎病毒1b基因型导致的难治性丙型肝炎患者在我国长江以北地区占有较大的比重。3.与普通性丙型肝炎相比,难治性丙型肝炎患者肝脏Th1/Th2细胞失衡更加严重,这种免疫调节功能失衡可能是难治性丙型肝炎抗病毒疗效不佳的重要原因之一。4.难治性丙型肝炎患者肝组织内Th17细胞相关细胞因子数量显著性升高,且IL-17阳性细胞数与难治性丙型肝炎肝组织内浆细胞浸润呈明显相关,推测肝脏Th17细胞的增多可能影响丙型肝炎抗病毒治疗的免疫应答状况,且与慢性丙型肝炎患者自身免疫现象发生率高有关。