家族性腺瘤样息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)是一种迟发性的常染色体显性遗传病,外显率80-100%,群体发生率约7.4/100 000,可在青少年起病,平均发生年龄25岁,患者表现为结直肠广泛而密集分布的腺瘤性息肉,伴消瘦、肠道梗阻和反复便血。如不治疗,患者在40岁前几乎无一例外的转化为结直肠癌。FAP的高外显率和高致癌性,构成了对FAP家系成员极其沉重的生理、心理、经济和社会压力,使得开展FAP家系的相关基因突变检测和基因诊断显得极为重要。一项有效FAP家系基因诊断技术将具有以下意义:(1)明确早期结直肠改变轻微患者的诊断,指导实施结肠全切加回肠吻合术,减低结直肠癌的发生。(2)进行无任何临床改变的FAP患者的症状前诊断,明确家系成员的FAP患病风险,有效开展早期检测和预防性治疗,避免癌肿发生,指导婚姻生育。(3)通过绒毛取材(chorionicvillus sampling)、羊膜腔穿刺(amniocentesis)或脐带穿刺(cordocentsis)手术,获得胎儿源性组织细胞,进行FAP家系成员妊娠期胎儿的基因产前诊断(prenataldiagnosis),选择性终止FAP患者妊娠,避免患病儿的出生,切断该病在家系继续遗传的途径。(4)建立相应的植入前遗传学珍断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)技术,通过体外受精胚胎移植(in-vitro fertilization,IVF)-胚胎活检-单细胞基因诊断技术,选择正常胚胎植入,防止异常妊娠发生,将产前诊断提前到妊娠发生之前。FAP的致病基因是结肠腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因,该基因位于染色体5q21-22,其cDNA克隆序列分析显示为—8 535bp生成的开放阅读框架,共有15个外显子。其中第15外显子最大,占该基因编码区的75%,是人类已知最大的外显子,长度6571bp。APC基因编码2843个氨基酸,作为Wnt通路的重要分子,参与细胞迁移、粘附、细胞增殖、分化与调亡等过程。研究已经证实,APC基因是一种肿瘤抑制基因。APC基因突变造成APC蛋白功能失活,Wnt/β连环蛋白功能增强,结合微管能力下降,影响细胞分裂和迁移,引起细胞增殖与细胞分化之间的平衡失调,细胞过度增殖,肿瘤发生。APC基因突变可分为体细胞突变和生殖细胞突变,其体细胞突变的60%～65%集中于密码子1286～1513之间约10%的编码区,该区因此被称为“突变密集区”(mutation clusterregion,MCR)。体细胞突变一般不会传递给后代,是散发性结直肠癌的重要发病原因。FAP的APC基因突变属生殖细胞突变,可以通过配子传递给后代。目前已知的生殖细胞APC基因突变类型有826以上,其中60%以上的突变位于第15号外显子的5’端。这一区域的主要突变类型为无义突变(30%)和移码突变(68%),其中密码子1061(8%)和1309(20%)为最常见的生殖细胞突变位点。大部分突变结果是在下游形成提前的终止密码子,使APC蛋白呈截短改变,导致APC蛋白的功能失活,从而引起肿瘤发生。目前,多数点突变对APC蛋白功能的影响已经明确,如密码子1309和1061的移码突变,1317和1307的无义突变等。但仍有部分点突变对FAP的发病和进展的影响目前尚存争议,其中有密码子1822、1125、1126和2502等的点突变。部分学者认为这些突变与可影响APC蛋白功能,对FAP发病有低危性,另有研究显示它们与FAP没有关联。对FAP家系的基因研究表明,约60-80%的FAP家族具有明确特异APC基因突变类型,可通过直接APC基因突变检测,完成各家系成员的基因诊断。其余20-30%的家族APC基因分析结果通常没有异常发现,推测原因有APC基因大片段的缺失常规方法无法检测、突变部位在内含子或调节区内、其他未知突变等等。因此在完成APC基因整个开放性可读序列8535bp的突变检测,无明确相关突变发现的情况下,可利用APC基因的各种连锁标记,进行FAP家系突变基因的间接诊断。简短串联重复(short tandem repeat,STR)是一种2-5个核苷酸为单位的串联重复,以(CA)n多见,一般发现在基因之间或基因的内含子中,很少在基因的编码序列中,在人类基因组中均匀分布,具有丰富的多态性,是常用的DNA标记。D5S318、D5S299、D5S82、D5S134和D5S346等是已知与APC基因密切连锁STR位点,其中D5S134位于APC基因上游1cM左右,D5S346位于APC基因下游30-70Kb附近,是CA重复多态。对APC基因突变筛查未果的家系,通过上述STR连锁标记,可以确认常规方法无法检测的FAP家系的异常APC基因,进行症状前患者的基因诊断。旨在检测我省一多代遗传FAP家系的APC基因突变类型,分析APC基因有关序列变化与该家系FAP发生的关系,探索建立适用于该家系的基因诊断方法,完成该家系成员的FAP发病风险预测,为开展该家系的产前诊断和植入前遗传学诊断奠定基础,我们对该家系三代39名成员进行APC致病基因突变检测和STR连锁标记研究。第一部分家族性腺瘤样息肉病家系APC基因突变检测目的完成我省一个多代遗传的FAP家系成员APC基因序列分析,确定突变类型,分析其序列改变与FAP发病的关系,为进行遗传咨询、症状前诊断、产前诊断及植入前遗传学诊断奠定基础。材料和方法(1)FAP家系概况:图1所示为我省一FAP家族的家系图,共五代71名成员。第1代男女双方均已病故,其中男方(Ⅰ-1)为该家系已知的第一位患者。第Ⅱ代6名直系成员中有FAP患者4人,其中3人因结直肠癌病故。第Ⅲ代18名直系成员中有FAP患者8人,均发生在上代有FAP患者的家庭,其中4人结直肠癌已病故。第Ⅳ代除Ⅳ-1已明确为FAP患者外,其余个体目前尚未发现FAP的临床改变。第五代目前仅一人,仍年幼。(2)抽取39名成员FAP家系的外周静脉血,EDTA抗凝,抽提基因组DNA。其中第Ⅱ代成员7名,Ⅱ-6～Ⅱ-12;第Ⅲ代16名,Ⅲ-4、Ⅲ-7、Ⅲ-10、Ⅲ-13、Ⅲ-15～Ⅲ-19、Ⅲ-23、Ⅲ-25、Ⅲ-27及Ⅲ-30～Ⅲ-33;第Ⅳ代16名,Ⅳ-1、Ⅳ-3、Ⅳ-5、Ⅳ-6、Ⅳ-8～Ⅳ-11、Ⅳ-13～Ⅳ-18、Ⅳ-20和Ⅳ-23。同时从无家族遗传病史、无肿瘤病史、相互无血缘关系的37名正常人群中抽取外周静脉血,EDTA抗凝,抽提基因组DNA,作为对照。(3)参照文献分别合成APC基因各外显子聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)引物,共35对。其中1～14号外显子各一对,设代码为e1～e14,15号外显子21对,设代码为e15-1～e15-21,扩增产物覆盖整个APC基因外显子序列。(4)首先对家系中5名患者(Ⅱ-11、Ⅲ-15、Ⅲ-17、Ⅲ-30和Ⅳ-1)进行上述所有35对引物引导的PCR扩增,其PCR产物直接测序,发现突变位点,用限制性内切酶酶切证实突变位点。(5)以患者中发现的APC突变位点的扩增区间为目的DNA片段,对FAP家系其余34名成员基因组DNA样本进行PCR扩增,PCR产物直接测序和限制性内切酶酶切分析。(6)以患者中发现的APC突变位点的扩增区间为目的DNA片段,对照组37份基因组DNA样本行PCR扩增,限制性内切酶酶切确定突变位点。(7)应用SPSS15.0统计软件,对突变位点在FAP患者、非患者的直系成员、对照人群的发生率进行比较。结果(1)FAP患者APC基因PCR产物测序:参照www.ncbi.nlm.nih.gov正常APC序列,五名FAP患者的e1～e14、e15-1～e15-11和e15-13～e15-21 PCR扩增区间的DNA序列无异常发现。但有两名患者的e15-12扩增产物发现1822氨基酸位点存在突变:碱基腺嘌呤转为胸腺嘧啶(A-T),密码子编码的氨基酸由原来的天冬氨酸变为缬氨酸(Asp1822Val)。另三名患者e15-12扩增产物1822氨基酸位点无变化。应用限制性核苷酸内切酶BpiI(酶切位点:5’-GAAGAC(N)2↓-3’,3’-CTTCTG(N)6↓-5’)酶切后电泳证实,Asp1822Val发生率为2/5(40.0%)。(2)对FAP家族其余34名成员e15-12 PCR扩增产物测序结果显示:有2例为Asp1822Val,分别是直系成员患者Ⅲ-15的女儿Ⅳ-13和配偶Ⅲ-16。其余32名成员序列正常,结果均经BpiI酶酶切后电泳证实。Asp1822Val在受检直系成员中的发生率为1/25(4.0%),其中已确定为非FAP患者的直系成员10名,无一发生Asp1822Val;在受检成员配偶中的发生率为1/9(11.1%)。(3)对37例对照组成员e15-12 PCR扩增产物的BpiI酶酶切结果显示:有7例为Asp1822Val,出现频率为7/37(18.9%)。以上所有实验均经重复证实。(4)Fisher’s Exact Test统计表明,Asp1822Val的发生率在FAP患者、非患者的直系成员、对照人群间没有显著性差异(P＞0.05)。结论(1)该FAP家系APC基因外显子1～14无明确的基因突变。(2)APC基因15号外显子的Asp1822Val改变与该家系的FAP发病无明显的关联,提示Asp1822Val应该是APC基因15号外显子的一种多态现象。(3)为开展该FAP家系APC基因诊断,有必要进行该家系APC基因的连锁标记研究。目的完成我省一个多代遗传的FAP家系成员APC基因STR连锁标记分析,建立应用STR连锁标记进行该FAP家系致病APC基因诊断的技术,进行该家系成员的症状前诊断和FAP发病风险评估,为该家系的FAP的产前基因诊断提供技术保证,为开展FAP植入前遗传学诊断奠定基础。方法(1)FAP家系概况:同实验一。(2)同实验一,抽取FAP家系的39名成员的外周静脉血,EDTA抗凝,抽提基因组DNA。(3)依据文献设计APC基因紧密连锁的STR标记D5S346和D5S134引物对,对上述所有FAP家系成员进行D5S346和D5S134的PCR扩增。(4)PCR产物经8%非变性聚丙稀酰胺凝胶垂直电泳,银染,定影,干燥。(5)按PCR产物泳动速度快慢分别将D5S346的PCR扩增产物分别命名为A1、A2、A3和A4;将D5S134的PCR扩增产物依次命名为B1、B2、B3和B4。实验经重复证实。结果(1)该家系已临床确诊的5名FAP患者其D5S346和D5S134的基因型分别为:A1B2/A1B4、A3B1/A1B4、A3B3/A1B4、A1B2/A1B4、A1B2/A1B4,均含有A1B4单倍型。(2)该家系已临床排除FAP的直系成员除Ⅲ1-13外,均无A1B4单倍型存在。其中Ⅱ-7和Ⅱ-9的四名后代(Ⅳ-15～Ⅳ-18)也未见单倍型A1B4存在。家系直系成员的9名配偶也无A1B4单倍型存在。(3)该家系目前尚未发现FAP临床改变的直系成员中,有Ⅳ-5、Ⅳ-6、Ⅳ-9、Ⅳ-11、Ⅳ-14和Ⅳ-23存在单倍型A1B4。其中Ⅳ-5是已故FAP患者Ⅲ-3的后代,Ⅳ-6是已故患者Ⅲ-5的后代,Ⅳ-9是患者Ⅲ-11的后代,Ⅳ-14是患者Ⅲ-17的后代,Ⅳ-23是患者Ⅲ-30的后代。但Ⅳ-11是已临床排除FAP的Ⅲ-13后代。结论(1)STR多态位点D5S346和D5S134单倍型A1B4与该FAP家系致病APC基因紧密连锁。(2)该家系目前尚未发现FAP的临床改变的直系成员Ⅳ-5、Ⅳ-6、Ⅳ-9、Ⅳ-14和Ⅳ-23为症状前FAP患者的可能极大,应尽早进行相应的临床检查和处理。(3)对该家系中仍有生育计划的FAP患者家庭,建议应用本研究业已建立的D5S346、D5S134 STR连锁标记检查方法,利用其单倍型A1B4进行产前诊断,避免患病儿的出生。(4)对可能的症状前患者Ⅳ-5、Ⅳ-6、Ⅳ-9、Ⅳ-14和Ⅳ-23,应进行婚姻咨询、产前咨询、产前诊断,避免患病儿的出生,切断该病在家系继续遗传的途径。(5)应发展建立单细胞的D5S346、D5S134 STR连锁标记分析方法,开展该家系的FAP植入前遗传学诊断,避免异常妊娠发生,将产前诊断提前到妊娠发生之前。(6)由于在配子成熟分裂中存在等位DNA片段的交换,应用本研究STR标记连锁分析进行的FAP家系基因诊断存在一定的误诊率。故对FAP患者后代中不存在A1B4单倍型的个体,仍有定期进行FAP相关检查的必要。