背景：结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,在西方发达国家,结直肠癌的发病率居第3位,病死率居第4位,其5年生存率为50-60%[¨。在我国,结直肠癌的发病率居恶性肿瘤的第3位,病死率居第5位。随着社会进步和生活改善,我国结直肠癌的发病率和病死率正呈明显的上升趋势。因此,对结直肠癌患者寻找有效的早诊断、早治疗手段就迫在眉睫。目前,化疗是针对结直肠癌综合治疗重要手段之一,临床上由奥沙利铂(oxaliplatin, OXA)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)与亚叶酸钙组成的FOLFOX4方案已广泛用于结直肠癌的治疗,并有明显疗效。但是,临床上化疗疗效不理想的现象也是常见的,晚期阶段的结直肠癌对目前的化疗药物反应差并且预后极差,目前已认识到相同TNM分期的患者也具有不同的预后和对治疗的反应。引起化疗疗效不理想的原因很多,可能主要是：机体对化疗药敏感性差甚至排斥、肿瘤本身对化疗药物抵抗、肿瘤对化疗药物产生多药耐药性multidrug resistance, MDR)等,其中多药耐药是主要原因,这也是目前人们关注热点之一。Twist基因是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子,在胚胎形态发生中起关键调控作用,广泛参与调控器官生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程。宫奇林等检测112例结直肠癌组织及40例正常肠黏膜组织中Twist的表达,结果发现在112例结直肠癌组织中,Twist基因阳性表达78例(69.6%),正常组织中为15例(17.5%),两者比较差异有统计学意义,且Twist在结直肠癌组织中表达与肿瘤的分化程度、肿瘤浸润和淋巴结转移等有关。Twist的高表达往往提示结直肠癌预后差、易发生转移。同时,研究发现Twist基因在多种肿瘤细胞中的过度表达,在抗细胞凋亡、肿瘤的多药耐药性、上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、血管的发生和肿瘤的侵袭与转移等方面起到了非常重要的作用。Meng DW研究发现Twistl表达下调而诱导细胞凋亡,增强鼻咽癌对紫杉醇药物的敏感性,提示Twistl是鼻咽癌治疗的一个靶基因[9]。Cheng等研究指出,在乳腺癌细胞中,Twist表达上调,癌细胞的运动、侵袭和对紫杉醇的耐药性明显增加。由于Twist上调了Akt2,乳腺癌细胞产生对紫杉醇的耐药,同时增强了癌细胞的侵袭转移能力。由此可见,Twist在多药耐药方面起着重要的调控作用,但具体机制还不是很清楚。Twist基因与肿瘤耐药之间的关系是目前的研究热点,既往的研究发现Twist可以通过不同的作用途径调控化疗药物对肿瘤细胞的影响。但Twist基因在结直肠癌细胞对奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中是否发挥着作用目前尚无研究报道。故本实验通过研究Twist基因与结直肠癌生物学特性以及发生、发展之间的关系,及探讨Twist基因在结直肠癌细胞奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中的作用,从而寻找到结直肠癌新的治疗靶点,增强对结直肠癌细胞的杀伤作用,为临床诊断和治疗提供帮助。目的1、研究Twist基因与结直肠癌生物学特性以及发生、发展之间的关系及与结直肠癌患者术后预后的关系。2、探讨Twist基因在结直肠癌细胞奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中的作用。方法第一部分Twist基因在结直肠癌中的表达及其对预后的影响应用免疫组化SP法检测95例有完整临床病理资料和随访记录的结直肠癌患者的石蜡切片,观察各组织中Twist的表达情况,分析其表达和临床病理特征之间的关系,并进行生存分析及Cox比例风险回归模型分析。第二部分Twist基因在结直肠癌奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中的作用研究1、应用免疫荧光、RT-PCR、Western blot分别检测SW480、HCT116、Lovo细胞Twist mRNA及蛋白水平的表达。利用Twist过表达质粒、Twist-siRNA质粒转染三株细胞,分别使三株细胞中Twist基因高表达或低表达,利用RT-PCR、 Western blot检测其转染情况。2、应用MTT法检测不同浓度的奥沙利铂及氟尿嘧啶在不同时间对结直肠癌SW480、HCT116、Lovo细胞增殖的影响。在各个实验组分别加入不同浓度的奥沙利铂和氟尿嘧啶溶液,避光条件下分别作用24、48、72、96h,在每个终止时间点用MTT法分别检测奥沙利铂和氟尿嘧啶对三株细胞增殖的影响,筛选出奥沙利铂和氟尿嘧啶分别对细胞在SW480、HCT116、Lovo细胞48h的半抑制浓度(IC50)。用浓度为IC5048h奥沙利铂与IC50ah氟尿嘧啶(体积比例=1：1),对经不同处理后的三株细胞作用48h后,检测Twist基因对细胞增殖的影响。3、应用流式细胞术检测用浓度为IC5048h奥沙利铂与IC5048h氟尿嘧啶(体积比例=1：1),对经不同处理后的三株细胞作用48h后,Twist基因对细胞的凋亡率的影响。各细胞经干扰、过表达处理后,按5x106/皿接种于150mm培养皿中,按处理分组及给药办法将药物加入各实验组中,在终止时间点用流式细胞术检测每组的凋亡率。结果第一部分Twist基因在结直肠癌中的表达及其对预后的影响Twist蛋白的表达位于组织细胞的细胞质和细胞核,以细胞质为主。结直肠癌组织中Twist蛋白的阳性表达率显著高于相应正常结直肠黏膜组织,两者比较,差异有统计学意义(χ2＝6.623,P<0.01)。结直肠癌组织中Twist蛋白的表达在结直肠癌患者的肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、复发等方面比较,差异有统计学意义(P<0.05),而在患者性别、年龄、肿瘤部位等方面比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示与Twist表达阴性的患者术后生存率明显高于Twist表达阳性患者(Log-rank检验χ2=35.189,P<0.001)。经单因素分析显示,肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、Twist蛋白表达是结直肠癌病人术后生存率的危险因子。经多因素分析显示,淋巴结转移和Twist蛋白表达是病人术后死亡的独立危险因子。第二部分Twist基因在结直肠癌奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中的作用研究1、免疫荧光、RT-PCR、Western blot结果显示HCT116、Lovo细胞中Twist基因的表达分别与SW480细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05)。Twist mRNA在高转移HCT116、Lovo细胞株中的表达量显著高于SW480,组间差异有统计学意义(P<0.05)。Twist mRNA在Lovo细胞株中的表达量显著高于HCT116,差异有统计学意义(P<0.05)。在SW480、HCT116、Lovo细胞中,干扰组Twist mRNA表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；过表达组Twist mRNA表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组、干扰对照组、过表达对照组组间中细胞的Twist mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。而Western blot结果提示Twist蛋白的表达情况与Twist mRNA的表达情况一致。2、MTT法结果显示：奥沙利铂、氟尿嘧啶均对SW480、HCT116、Lovo细胞抑制作用随着浓度升高和作用时间延长而逐渐增强,呈剂量、时间依赖性；奥沙利铂对SW480、HCT116、Lovo细胞48h半抑制浓度1C5048h分别为0.66μg/ml、 11.86μg/ml、5.75μg/ml;氟尿嘧啶对SW480、HCT116、Lovo细胞48h半抑制浓度IC5048h为94.83μg/ml、1.84μg/ml、27.66μg/ml;在浓度为IC5048h氟尿嘧啶与IC5048h奥沙利铂联合作用于不同处理后的SW480、HCT116、Lovo细胞48h后,干扰组细胞抑制率显著高于阴性对照组(P<0.05),而过表达组细胞抑制率显著低于阴性对照组(P<0.05)。3、流式细胞术结果显示：在浓度IC5048h氟尿嘧啶与IC5048h奥沙利铂联合作用于经不同处理后的SW480、HCT116、Lovo细胞48h后,SW480、HCT116、Lovo细胞中不同处理组的早期、晚期及总凋亡率的组间差异比较均有显著性差异(P<0.05)；干扰组细胞的早期、晚期及总凋亡率显著高于阴性对照组(P<0.05)；过表达组细胞的早期、晚期及总凋亡率显著低于阴性对照组(P<0.05)；在同处理下,SW480、HCT116、Lovo细胞总凋亡率的组间差异比较均有显著性差异(P<0.05)。结论1、Twist基因在结直肠癌发生、发展、转移和侵袭中起促进作用,是结直肠癌患者不良预后的独立危险因子。2、Twist基因在结直肠癌奥沙利铂、氟尿嘧啶耐药中发挥正向作用。